猴耳環提取方法和體外抑菌活性研究

李超

（四川省新獸藥工程技術研究中心，四川 溫江 611130）

猴耳環為含羞草科猴耳環屬植物，又名落地三錢、蛟龍木、雞三樹、圍涎樹，其葉、果實、種子均可入藥，主要分布于我國華南、西南地區，民間用于燒傷、燙傷的治療。現代臨床主要用于治療上呼吸道感染、急性胃腸炎、急性咽喉炎、急性扁桃體炎，亦可用于細菌性痢疾[1]。本文對猴耳環的提取和抑菌效果進行了研究，旨在為新獸藥產品的研發提供依據。

1 材料

1.1 儀器 RE-2000旋轉蒸發器，SWCJ-1F型超凈工作臺，HH-B11型隔水式電熱恒溫培養箱，LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器。

1.2 藥材 猴耳環，購自成都荷花池中藥材專業市場。

1.3 試驗菌株 細菌包括大腸桿菌、金色葡萄球菌、沙門氏桿菌，均購自中國獸醫藥品監察所；營養肉湯培養液，購自北京奧博星生物技術有限公司。

2 方法

2.1 猴耳環的提取

2.1.1 正交試驗 以提取液中沒食子酸含量為指標，采用正交試驗方案（表1），選取加水量、提取時間和提取次數為考察因素，每個因素選3個水平，對猴耳環的提取工藝進行篩選。

表1 因素水平表

2.1.2 猴耳環提取方法 根據正交試驗所確定的最佳提取工藝，將猴耳環放入粉碎機中粉碎，精密稱取100g，加入適量的蒸餾水，回流提取，將水煮液進行抽濾，濾液濃縮至100mL，即得樣品液。

2.2 體外抑菌試驗

2.2.1 菌懸液制備 將供試菌（大腸桿菌、沙門氏桿菌、金色葡萄球菌）菌種接種于營養瓊脂斜面培養基上進行活化，挑取單個菌落接種于新鮮營養肉湯培養基中，37℃培養18～24h，采用平板菌落計數法，用肉湯稀釋菌懸液濃度至含菌體約 1×105～1×106CFU/mL，保存備用。

2.2.2 體外抑菌活性測定 采用管碟法進行測定。取制備的菌懸液0.1mL分別放入營養瓊脂平板，用L棒涂布均勻，放入牛津杯，使其與培養基接觸良好，以無菌生理鹽水作陰性對照。每個牛津杯加入藥液0.1mL，然后將平板置于37℃恒溫培養箱中培養18～24h，取出，測定抑菌圈大小并記錄結果。

抑菌效果判定：抑菌圈直徑＞20mm為極敏感，15～20mm為高度敏感，10～15mm之間為中度敏感，抑菌圈直徑＜10mm為低度敏感。

2.2.3 MIC值測定 取已編號的滅菌試管5支，分別在1～5號試管中各加營養肉湯2mL，然后吸猴耳環提取液2mL于1號試管，采用倍比稀釋法稀釋至5號管（將藥液依次稀釋成1/2、1/4、1/8、1/16、1/32的不同濃度），搖勻后棄去2 mL，各管最終體積為2 mL，其生藥含量分別為 500、250、125、62.5、31.25mg/mL。然后在各試管中加入細菌菌懸液0.05mL，于37℃培養18～24h，肉眼觀察未渾濁的試管記為MIC值。

3 結果

3.1 最佳提取工藝 由表2可知，加水量為主要影響因素，次數和時間為次要影響因素，最佳組合為A2B3C3，即加水量30倍，提取2h，提取2次。

3.2 體外抑菌活性測定 結果見表3。

3.3 MIC值測定結果 猴耳環提取物對大腸桿菌的MIC值為500 mg/mL，對金色葡萄球菌的MIC值為125mg/mL，對沙門氏桿菌的MIC值為250mg/mL（見表 4）。

表2 正交試驗結果

表3 猴耳環提取液的體外抑菌活性 mm

表4 猴耳環提取液對細菌的最低抑菌濃度（MIC值）mg/mL

4 小結

根據有關文獻報道[2-3]，猴耳環的有效成分和指標性成分已基本明確，沒食子酸含量可作為藥材和制劑的質量控制指標，經過反復預試驗，我們發現提取次數、加水量、提取時間是主要影響因素，因此將這3個主要因素進行正交試驗。結果表明，猴耳環最佳提取工藝為加水量30倍，提取2h，提取2次，該提取工藝簡單，值得推薦。

猴耳環提取液對常見的金色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏桿菌均有較強的抑殺作用，然而限于實驗室條件，沒有對其抗菌譜進行全面研究。本試驗證明，猴耳環具有較好的抑菌作用，有作為藥物開發的應用前景。

[1] 李藥蘭，李克明，蘇妙賢，等.猴耳環抗病毒有效成分研究[J].中國中藥雜志，2006，31（5）：397-399.

[2] 張志堅，李鏡友，李國強.猴耳環研究進展[J].中國藥業，2010，19（18）：82-83.

[3] 陳軍，羅德珍，李鏡友，等.高效液相色譜雙波長法同時測定猴耳環消炎片中沒食子酸和槲皮苷含量[J].中國藥業，2015，24（21）：129-130.