中國大鯢皮膚分泌物的研究現狀

黃林艷，黃 曉，張婉清，朱廣香，王 勤

(四川農業大學生命科學學院動物學系，四川 雅安 625014)

中國大鯢(Andriasdavidianus)俗稱娃娃魚，屬兩棲類,有尾目,隱鰓鯢科，為我國特有的大型珍稀兩棲動物，廣泛分布于陜西、江西、四川、湖南、湖北等17個省。大鯢的肌肉、皮膚、器官、骨骼等都可以入藥，經常食用大鯢具有延緩衰老、聰明益智、促進造血和增強免疫功能的作用，有助于防治惡性貧血、心腦血管系統疾病和惡性腫瘤[1-2]。大鯢的皮膚不僅對其呼吸具有極大影響，在應對外界環境變化的防御機制中也存在不可或缺的作用。大鯢皮膚的真皮層存在黏液腺和顆粒腺這兩種多細胞腺體。黏液腺體細胞可釋放黏滑的分泌物，與水結合后成為黏液，覆蓋在上皮游離面，形成一道天然的防護屏障，具有防御、保濕、促進皮膚呼吸等作用[3]；而顆粒腺能夠分泌具有特殊性氣味的白色黏稠狀黏液，其成分是功能多樣的生物活性分子[4]。隨著大鯢養殖規模的發展，如何對大鯢進行進一步的深加工，成為該養殖業是否還能持續發展需要解決的一大難題。目前對于中國大鯢的研究利用，多是處死后進行，這對其資源的保護和繁殖極為不利。而大鯢皮膚表面廣布腺體，可采用非損傷性取樣方法收集體表分泌物，進行開發研究。這樣既不影響大鯢本身的生長繁殖，還能達到這一資源的最大限度利用。

1 大鯢皮膚分泌物中營養成分

大鯢皮膚分泌物的取樣均采用非損傷性取樣方法，即通過機械刺激或電刺激促使大鯢皮膚分泌黏液，真空冷凍干燥成凍干粉后保存，以供繼續研究。大鯢皮膚分泌物中的營養物質主要為蛋白質和多糖類物質，其氨基酸組成較為全面，包含谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸以及人體必需氨基酸等17種氨基酸，總量豐富[5]，蘇氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺和谷氨酸/谷氨酰胺的含量較高[6]，可以作為優質食物蛋白的來源。2014年，陳德經等人對分泌物進行了單糖組分分析，利用不同提取方法進行了粗提實驗，最后發現堿提取所得多糖率最高，單糖種類也最多，主要由甘露糖，葡萄糖醛酸及葡萄糖3種單糖組分組成[7]。針對大鯢皮膚分泌物營養物質的研究主要涉及以上幾種成分，還有研究發現分泌物中還含有少量脂肪[8]，而維生素以及無機鹽含量未見具體記錄。

2 大鯢皮膚分泌物藥理活性

大鯢皮膚顆粒腺能夠分泌具有特殊氣味的白色黏稠狀黏液，并含有功能復雜多樣的生物活性分子，可作為天然藥用資源進行開發利用。其藥理活性成分主要由糖類和蛋白質多肽組成，以糖蛋白、低聚糖肽等復合物和多肽的形式存在并發揮其生理活性。

大鯢皮膚分泌物中含有廣譜高效、不易產生耐藥性的抗菌活性物質，使得其不容易被細菌、真菌等微生物所侵染，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌均具有抵抗作用。Qu等采用SDS - PAGE、HPLC和質譜分析法從大鯢皮膚分泌物獲得由兩個相同的8.5 kDa亞基組成的凝集素，并了解到連接這兩個亞基的結構為二硫鍵，進一步研究發現該物質對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用與青霉素相差不大[9]。在此之前，Qu等還利用海洋曲霉菌酸性蛋白酶酶解大鯢皮膚分泌物，得到了分子量小于3 500 Da，具有O-連接糖肽鍵結構的大鯢低聚活性糖肽。該糖肽可顯著增加實驗小鼠血清IgG和巨噬細胞數量，提高T淋巴細胞活性，這也證明了大鯢皮膚分泌物具有增強小鼠免疫功能的作用[10-11]。王利鋒等人利用5%乙酸浸提、SephadexG-50/25凝膠過濾層析，從分泌物中獲得了一種分子量為4 300 Da，表現強陽離子特性的抗菌肽，對銅綠假單胞菌具有較強抗感染作用，且效果與磺胺米隆無明顯差異[12-13]。但是也存在一些研究結果與上述不一致，可能是因為提取濃度達不到抑菌濃度；或是由于提純條件控制不當，使其結構改變，活性改變，因此可借鑒提取兩棲類抗菌肽多采用的酸提法，因為酸性溶液易進入組織細胞，且抗菌肽多為堿性蛋白，在酸性條件下溶解度高，酸性條件還可抑制組織中影響抗菌肽活性的內源性蛋白酶的活性[14]。

大鯢皮膚分泌物具有調節生理代謝的功能，可產生抗氧化和抗疲勞的藥理作用。科學研究發現，癌癥，衰老等都與機體內過量的自由基有關，而抗氧化能力可幫助機體抵抗這些自由基的傷害。大鯢皮膚分泌物中含有可清除氧化自由基的有效成分，具有較好的抗氧化活性。曲敏和金橋等的研究結果都證明了提純的活性物質具有高效清除DPPH自由基，羥基自由基及超氧陰離子自由基的作用[15-16]。劉豪等還將對上述自由基的清除率與VC、VE作比較，發現其抗氧化性能雖不如VC，但與VE相差不大，且對DPPH自由基的清除率高于VE[8]。為了探究不同育齡大鯢皮膚分泌物中低聚糖肽的抗氧化能力，王茁利用3育齡和6育齡大鯢進行了實驗，結果表明，6育齡大鯢的低聚糖肽抗氧化性能強于3育齡，原因可能是6育齡的大鯢處于繁殖期，身體各項指標都已達到較優狀態[17]。抗氧化能力的發揮還可能延緩運動性疲勞發生和加快體能恢復，故又有研究者在利用小鼠負重游泳測其疲勞度的時候發現，灌服大鯢低聚糖肽的小鼠，肝糖原消耗量和肌肉中乳酸含量都較低，同時游泳時間還顯著增加，證明了大鯢皮膚分泌物具有抗疲勞作用[18]。

大鯢皮膚分泌物在防治疾病方面也具有一定作用。首先，在危害人類健康的三大殺手之一癌癥的研究中，徐偉良等人利用MTT比色法，發現所提純的糖蛋白樣品對人乳腺癌細胞MCF-7和肺癌細胞A 549的增殖均具有抑制作用[4, 19]，只是目前針對大鯢皮膚分泌物對癌癥發生發展的影響機制還沒有進一步的研究結果。其次，心血管疾病同癌癥一樣，是危害人類健康的重大疾病，有研究發現，大鯢皮膚分泌物具有良好的抗血小板凝集活性，與阿司匹林的作用相當，并對血管緊張素轉換酶(ACE)具有較好的抑制活性，因此還可將其作為抗血栓及抗高血壓藥物進行深入研究[20-21]。最后，在利用小鼠建立相關疾病模型的研究中發現，大鯢低聚糖肽可顯著抑制四氯化碳(CCl4)造成的血清中谷草轉氨酶(AST)與谷丙轉氨酶(ALT)活性的升高，降低肝臟組織丙二醛(MDA)含量，使肝組織損傷明顯減輕，具有護肝作用；在燙傷、凍傷治療方面，大鯢低聚糖肽可促進損傷組織修復，降低炎癥反應程度[22-24]。

大鯢皮膚分泌物還具有一定護膚作用。除已提到的抗氧化功能外，大鯢皮膚分泌物被進一步證實具有吸濕保濕，抗紫外線損傷的功能，可淡化色斑，修復皮膚，延緩皮膚衰老。在將其制備成面膜和潤膚膏進行人體試用后發現，受試者未出現不良反應，在使用面膜后，VISIA皮膚圖像分析系統結果顯示，皺紋、紫外線色素斑及棕色斑明顯改善，且受試者經過此項治療后，自覺皮膚狀態得到了改善[25-26]。

3 大鯢皮膚分泌物基因

目前，相對于其他兩棲動物，特別是蛙類來說，大鯢皮膚分泌物在基因方面的研究還較少。GUO等將提取到的分泌物采用Chelex法和12S rRNA基因序列進行擴增和測序，交叉比對發現得到的基因序列跟從肝臟中得到的序列是相同的，說明可采用非破壞性的方法來進行中國大鯢遺傳學方面的研究[27]。2017年，Yang等人成功得到了大鯢的第一個抗菌肽基因，與其他同源基因一樣，都具有一段相同的保守區域。其ORF序列由447 bp組成，編碼含148個氨基酸的多肽，包括一個由20個氨基酸殘基構成的信號肽，一個由94個氨基酸殘基構成的cathelin結構域，以及一個由34個氨基酸殘基構成的與其他物種完全不同的成熟肽。半定量PCR顯示其只在皮膚有表達，實時熒光定量PCR也顯示在皮膚中高度表達。這主要是因為皮膚作為大鯢防御外界危害的第一道防線，為抵抗病原微生物的侵襲，必將分泌大量抗菌活性因子，這也揭示了其在先天免疫反應中的重要作用[28]。

4 展望

兩棲動物皮膚對其維持自身生存和適應多樣化的生態環境具有不可或缺的作用，可幫助其進行呼吸作用，保持水分，抵抗病原微生物侵襲及天敵捕食等。它們皮膚腺體所分泌的物質，是發揮以上作用的主要來源。故多年來，兩棲類動物皮膚分泌物一直是研究熱點，并已經有部分研究成果進入到了臨床試驗階段，特別是蛙皮素與抗菌肽。在哺乳動物中也存在相似功能物質的蛙皮素，對免疫、神經、消化系統都具有廣泛的作用，目前的研究主要涉及抑制其受體作用，從而達到治療腫瘤的目的方面[29]。抗菌肽的研究成果是已經將蛙科動物皮膚抗菌肽分為若干個抗菌肽家族，對其作用機制也有了初步研究，可能是通過形成“膜通道”使胞內物質外溢，及其“選擇性殺傷”機制來實現抗菌作用[30-31]。相對于蛙科動物的研究，同樣作為兩棲動物的大鯢，其皮膚分泌物還存在很多未解之謎，例如當中具有一定生理功能的成分具體是什么，它們的作用機制是什么，如何有效提純這些成分，還不甚清楚。與此同時，大鯢皮膚分泌物具有一定臭味，粗提物急毒性的試驗結果也表明其具有低毒性，經分析檢測后發現其成分分別為8種氨基酸和二甲基二硫醚，可經乙醇脫毒和酶解后開發利用[32-33]，但也有研究發現其粗提物在100 ℃下水浴10 min后也可脫毒[34]。所以大鯢皮膚分泌物中存在的毒性成分是什么，如何保證安全利用，還需要繼續研究。只有將限制開發的難題逐漸攻克，才能保證更好地利用大鯢這一生物資源。

參考文獻：

[1] 李時珍, 御史. 新編本草綱目[M]. 北京科學技術出版社, 2012.

[2] 張神虎. 大鯢藥用價值及人工養殖[J]. 基因組學與應用生物學, 2001, 20(4): 309-310.

[3] 唐以杰, 曾小龍, 方昆陽. 中國大鯢皮膚的組織學觀察[J]. 廣東科技, 1999(7):26-27.

[4] 徐偉良, 陳德經, 劉宇, 等. 大鯢皮膚粘液糖蛋白的提取純化及抗肺癌活性研究[J]. 中國生化藥物雜志, 2015, 35(8): 44-47.

[5] 陳德經. 大鯢黏液、皮膚及肉中氨基酸分析[J]. 食品科學, 2010, 31(18):375-376.

[6] 金橋, 成芳, 曲敏, 等. 大鯢的開發研究現狀[J]. 廣州化工, 2012, 40(2):9-10.

[7] 陳德經, 徐偉良, 蘇文, 等. 大鯢皮膚黏液多糖的提取及單糖組成分析[J]. 天然產物研究與開發, 2015, (10): 1700-1705.

[8] 劉豪. 大鯢黏液糖蛋白及其潤膚品制備研究[D]. 天津科技大學, 2016.

[9] QU M, Tong C, Liang K, et al. Purification of a secreted lectin fromAndriasdavidianus, skin and its antibacterial activity[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp, 2015, 167:140-146.

[10] QU M, KONG L, WANG W, et al. Preparation and characterization of skin secretion hydrolysates from giant salamander (Andriasdavidianus)[C]// International Conference on New Technology of Agricultural Engineering. IEEE, 2011:931-934.

[11] 曲敏, 閆欣, 李偉, 等. 大鯢低聚糖肽對小鼠免疫功能調節作用的研究[J]. 北京農學院學報, 2012, 27(1): 42-44.

[12] 王利鋒, 李學英, 王大忠. 大鯢皮膚分泌液中抗菌肽對銅綠假單胞菌感染小鼠創面的抗菌作用[J]. 華西藥學雜志, 2011, 26(4): 336-339.

[13] 王利鋒, 李學英, 王大忠. 大鯢皮膚分泌液中抗菌肽的鑒定及生物活性研究[J]. 中國生化藥物雜志, 2011, 32(4): 269-272.

[14] 馬瑜, 孫燕, 李治. 兩棲類皮膚抗菌肽的分離純化與抗菌活性檢測技術[J]. 藥物生物技術, 2010(1):83-86.

[15] 金橋, 魏芳, 佟長青, 等. 大鯢糖肽組分的高效液相色譜分析及其抗氧化活性研究[J]. 北京農學院學報, 2011, 26(1): 27-29.

[16] 曲敏. 大鯢黏液低聚糖肽的制備、性質和生物活性及應用研究[D]. 沈陽農業大學, 2012.

[17] 王茁. 不同育齡大鯢皮膚粘液中低聚糖肽抗氧化活性研究[J]. 陜西農業科學, 2015(8):34-36.

[18] 李偉, 于新瑩, 佟長青, 等. 大鯢黏液酶解產物的制備及其抗疲勞作用研究[J]. 食品工業科技, 2011, 32(6): 146-148.

[19] 陳德經, 張建強, 劉青. 大鯢皮膚黏液提取物制備抗乳腺癌藥物及其應用：中國, CN105769926A[P]. 2016.

[20] 陳麗萍, 蔡劍雄, 王劍. 大鯢黏液低聚糖肽抑菌、抗血小板聚集活性研究[J]. 亞太傳統醫藥, 2015, 11(1): 11-13.

[21] 胡代花. 大鯢生物活性肽和酶解產物研究及應用進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫, 2017(5):75-79.

[22] 陳曦, 王楊科, 陳德經. 大鯢皮膚和黏液抑菌效果及其中藥膏制劑對燙傷的影響[J]. 中藥藥理與臨床, 2012(5):111-114.

[23] 曲敏, 田麗冉, 佟長青, 等. 大鯢低聚糖肽對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用[J]. 食品工業科技, 2013, 34(14): 350-352.

[24] 萬軍梅, 敖明章, 余龍江. 大鯢不同部位制備物治療燙傷與凍傷作用研究[J]. 醫藥導報, 2013, 32(5): 603-604.

[25] 趙小忠, 魏寧, 張良振, 等. 大鯢低聚糖肽抗皮膚光老化的臨床研究[J]. 中國醫療美容, 2014(3):78-80.

[26] 王睿, 李偉, 孔亮, 等. 大鯢糖肽潤膚霜的制備及性能評價[J]. 廣州化工, 2011, 39(6): 47-49.

[27] Guo W, Ao M, Li W, et al. Skin secretion and shedding is a good source for non-destructive genetic sampling in the Chinese giant salamander (Andriasdavidianus)[J]. Zeitschrift Für Naturforschung C Journal of Biosciences, 2013, 68(3-4):164.

[28] YANG H, Lu B, Zhou D, et al. Identification of the first cathelicidin gene from skin of Chinese giant salamandersAndriasdavidianus, with its potent antimicrobial activity[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2017, 77:141-149.

[29] GUO M, QU X, QIN X Q. Bombesin-like peptides and their receptors: recent findings in pharmacology and physiology[J]. Current Opinion in Endocrinology Diabetes & Obesity, 2015, 22(1): 3.

[30] 金莉莉, 王秋雨. 蛙科兩棲動物皮膚抗菌肽的分子多樣性及功能[J]. 遺傳, 2008, 30(10): 1241-1248.

[31] 黎觀紅, 洪智敏, 賈永杰, 等. 抗菌肽的抗菌作用及其機制[J]. 動物營養學報, 2011, 23(4): 546-555.

[32] 徐偉良, 陳德經, 魏泓, 等. 大鯢皮膚黏液的抗氧化性及安全性評價研究[J]. 陜西理工學院學報(自科版), 2015 (2):56-61.

[33] 徐偉良, 陳德經. 大鯢皮膚分泌物氣味成分分析及脫臭方法研究[J]. 安徽農業科學, 2014(35):12537-12538.

[34] GUO W, AO M, LI W, et al. Major biological activities of the skin secretion of the Chinese giant salamander,Andriasdavidianus[J]. Zeitschrift Fur Naturforschung C Journal of Biosciences, 2012, 67(1-2): 86.

Abstract：Chinese giant salamander(Andriasdavidianus) is a unique amphibian species in China, and the current research on Chinese giant salamander is mainly about biological evolution, biodiversity, and the molecular mechanisms of gender deter mination. However, with the rise of the study of amphibian skin secretion, people gradually found that the skin of Chinese giant salamander can secrete large amounts of active substances, which have good medicinal and nutritional value. In order to provide valuable reference for researchers, we collated and reviewed the researches of Chinese giant salamander skin secretion , which involved nutritional composition, pharmacological activity and gene, and looked forward to its future research.

Keywords：Chinese giant salamander(Andriasdavidianus); skin secretion; nutritional composition; pharmacologically activity; gene