食品中生物素檢測(cè)方法概論

□ 華晶忠 吉林省經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院 劉笑笑 魏春雁 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所

生物素即維生素B7，又稱維生素H、輔酶R等，它是合成維生素C的必要物質(zhì)，同時(shí)在脂肪合成、糖質(zhì)新生等生化反應(yīng)中扮演著重要角色，是脂肪和蛋白質(zhì)正常代謝不可或缺的物質(zhì)。生物素能構(gòu)成視沉細(xì)胞內(nèi)感光物質(zhì)，維持上皮組織結(jié)構(gòu)完整和健全，增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)和抵抗力。嬰兒若缺乏生物素會(huì)造成嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)躁狂、嗜睡和發(fā)育遲緩，因此生物素也為嬰幼兒配方食品必檢項(xiàng)目。

到目前為止，美國(guó)AOAC以及我國(guó)國(guó)標(biāo)GB 5009.259-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物素的測(cè)定》都將微生物法作為生物素檢測(cè)的首選方法和仲裁方法。

國(guó)標(biāo)微生物法維生素檢測(cè)前處理復(fù)雜，操作步驟繁瑣，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確主要應(yīng)掌握以下幾點(diǎn)。

1 玻璃器皿處理

國(guó) 標(biāo) GB 5009.259-2016 中 沒(méi) 有提及試管等玻璃器皿的處理，但是在國(guó) 標(biāo) GB 5009.210-2016《 食 品 安 全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中泛酸的測(cè)定》及GB 5009.89-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定》中都特別注明玻璃器皿的處理，可見(jiàn)玻璃器皿中殘留的物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不小。建議所有玻璃器皿先用清水浸泡0.5 h后，用去污粉洗刷，流水沖洗3遍以上，再用去離子水潤(rùn)洗3遍以上，瀝干后放入烘箱170 ℃干熱3 h后使用。此外，生物素檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所有用品都要實(shí)驗(yàn)專用，不與其他實(shí)驗(yàn)混合使用。

2 菌株制備

試驗(yàn)前一天下午把活化好的菌株轉(zhuǎn)種至已滅菌的乳酸桿菌肉湯中，第二天早上要密切注意菌株的生長(zhǎng)情況，肉湯渾濁但尚未出現(xiàn)沉底的情況即可取出培養(yǎng)箱備用。

3 試樣制備

樣品處理時(shí)降溫過(guò)程要迅速，避免顏色變化。樣品稀釋后的生物素濃度（一般可通過(guò)樣品標(biāo)簽標(biāo)示值獲得）應(yīng)盡量被標(biāo)準(zhǔn)溶液的系列梯度所覆蓋，必要時(shí)多選幾個(gè)稀釋度。

4 標(biāo)準(zhǔn)系列管配置

配置標(biāo)準(zhǔn)系列管時(shí)，用來(lái)裝水、裝培養(yǎng)基和標(biāo)液的瓶子以及相應(yīng)的移液管都應(yīng)專用，避免生物素交叉污染。配置標(biāo)準(zhǔn)系列管時(shí)，建議按照：添加水—添加培養(yǎng)基—蓋上空白管的試管帽—添加標(biāo)液和樣品稀釋液的操作順序。

5 培養(yǎng)

配置完后所有試管應(yīng)放入滅菌鍋內(nèi)，105 ℃滅菌5 min后取出迅速冷卻，避免顏色變化。

向每支測(cè)試管接種調(diào)好濁度的菌懸液，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定是接種一滴。試驗(yàn)證明一滴的菌懸液其實(shí)大小不一，很難保證向每支測(cè)定管中加入的菌量保持一致。所以，建議前面配置標(biāo)準(zhǔn)系列管時(shí)除了空白管加入5 mL測(cè)試培養(yǎng)基外，其余試管都加入4 mL培養(yǎng)基。滅菌后，將菌懸液加到剩余測(cè)試培養(yǎng)基中，混合后再向每根測(cè)試管加入1 mL混合菌液的培養(yǎng)基，這樣更能保證加入相對(duì)等量菌量。

6 測(cè)定

所有試管培養(yǎng)16 h后，要注意觀察菌生長(zhǎng)情況，在空白接種管菌株生長(zhǎng)的透光率不小于90%的情況下，直至標(biāo)準(zhǔn)系列管獲得最大渾濁度。

7 結(jié)果分析

微生物的生長(zhǎng)與待測(cè)試樣中生物素含量呈線性關(guān)系，所以標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定以標(biāo)準(zhǔn)系列管生物素含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)比較透光率與標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算試樣中生物素的含量。實(shí)驗(yàn)證明，微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中還會(huì)受到競(jìng)爭(zhēng)與抑制作用，隨著生物素濃度的增加，吸光度增長(zhǎng)趨緩。標(biāo)準(zhǔn)曲線各個(gè)點(diǎn)并不是嚴(yán)格分布在直線上，因此通常情況下標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)大于0.95就可以接受。

8 結(jié)語(yǔ)

GB 5009.259-2016方法關(guān)鍵在于細(xì)節(jié)要做好，檢測(cè)操作人員需要積累一定的經(jīng)驗(yàn)。考慮到這些情況，標(biāo)準(zhǔn)中也規(guī)定可采用預(yù)先包埋了菌種的微生物法生物素試劑盒測(cè)定。試劑盒法在相同原理下對(duì)方法進(jìn)行了改進(jìn)，更加簡(jiǎn)便，將稀釋的樣品提取物和生物素檢測(cè)培養(yǎng)基加入包埋了菌種的微孔中。孵育條件應(yīng)為37 ℃黑暗條件下44 ～ 48 h。最后通過(guò) ELISA reader在610～630 nm（或者540～50 nm）讀取結(jié)果。所用玻璃器皿在使用前需用一定濃度鹽酸漂洗，然后再用蒸餾水250 ℃條件下加熱1 h以保證無(wú)化學(xué)殘留物和微生物污染。樣品的過(guò)濾、稀釋與檢測(cè)前的準(zhǔn)備工作則與整個(gè)檢測(cè)過(guò)程一樣必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行，檢測(cè)的每個(gè)步驟都需要校正，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品應(yīng)該進(jìn)行3次檢測(cè)。