尿多酸肽注射液中大孔樹脂有害殘留物的檢查方法研究

王 剛

（泰凌生物制藥江蘇有限公司，江蘇泰州225300）

0 引言

尿多酸肽注射液常與化療聯合應用，可用于晚期乳腺癌、非小細胞肺癌的輔助治療，近年還用于骨髓增生異常綜合征的治療。在尿多酸肽注射液合成過程中，使用了大孔樹脂吸附工藝，樹脂中可能存在的有害殘留物為苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯等。參照《中國藥典》（2015年版）一部收錄的“三七總皂苷”[1]樹脂殘留檢測相關方法及限度，苯的限度定為0.000 2%，甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的限度定為0.002%。由于尿多酸肽注射液在生產過程中使用了95%乙醇作為洗脫劑，在極性柱中苯與乙醇難以分離，故本文建立了兩種分析方法進行測試，采用毛細管氣相色譜法，以頂空進樣方式分別用方法1測定甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的殘留量，用方法2測定苯的殘留量，均具有較高的準確度、精密度。

1 儀器、試藥

1.1 儀器

AUW120D島津十萬分之一天平；Agilent 7890A氣相色譜儀（FID檢測器）；Agilent OpenLAB色譜工作站；Agilent 7694E頂空進樣器；Agilent VF-WAXms（30 m×250μm×0.25μm）毛細管色譜柱；Agilent DB-624（30 m×0.32 m×1.8μm）毛細管色譜柱。

1.2 試藥

尿多酸肽注射液，由泰凌生物制藥江蘇有限公司提供；乙醇（GENERAL-REAGENT）、苯、N，N-二甲基甲酰胺（以下簡稱為DMF），國藥集團化學試劑有限公司；甲苯，上海凌峰化學試劑有限公司；對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯（adamas-beta）均為不低于99%的試劑；二乙烯苯（阿拉丁）為80%的試劑。乙醇（GENERAL-REAGENT）、苯、DMF、甲苯，均為分析純。

2 溶液的配制

2.1 方法1對照品溶液配制

2.1.1 對照品貯備液配制

精密稱取甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯各20 mg、二乙烯苯25 mg，置同一個10 mL量瓶中，加DMF溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品母液1；再精密量取1.0 mL置100 mL量瓶中，加DMF稀釋并定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備液1。

2.1.2 對照品溶液配制

精密量取10.0 mL對照品貯備液1置100 mL量瓶中，加25%DMF稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液1。

2.2 方法2對照品溶液配制

2.2.1 對照品貯備液配制

精密稱取苯20 mg置10 mL量瓶中，加DMF溶解并定容至刻度，搖勻，精密量取1.0 mL置100 mL量瓶中，加DMF定容至刻度，搖勻，作為對照品母液2；再精密量取10 mL置100 mL量瓶中，加25%DMF定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備液2。

2.2.2 對照品溶液配制

精密量取10.0 mL對照品貯備液2置100 mL容量瓶中，加25%DMF稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液2。

2.3 定位溶液

精密稱取苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、乙醇各20 mg、二乙烯苯25 mg，分別置10 mL量瓶中，加DMF溶解并定容至刻度，搖勻；再分別精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加25%DMF定容至刻度，搖勻，作為相應的定位溶液。

2.4 混合定位溶液

精密稱取尿多酸肽注射液（160402批）供試品1g，置10 mL量瓶中，分別精密量取1.0 mL的對照品貯備液1、對照品貯備液2，加25%DMF溶解并定容，搖勻，作為混合定位溶液。

2.5 供試品溶液配制

精密稱取尿多酸肽注射液（160402批）供試品約1 g，置10 mL量瓶中，加25%DMF溶解并定容，搖勻，作為供試品溶液。

3 甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯研究

3.1 測定法

取對照品溶液1頂空進樣，記錄色譜圖，甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯各峰的分離度均應符合規定，理論板數不低于5 000；再取供試品溶液頂空進樣，記錄色譜圖，按面積外標法計算甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的含量，含甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯均不得超過0.002%。

3.2 分析方法驗證

3.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent VF-WAXms（30 m×250μm×0.25 μm）；載氣：高純氮氣；分流比：10∶1；恒壓模式：15×6 894.757 Pa；氣化室溫度：210 ℃；檢測器溫度：230℃；柱溫：初始60℃，維持16 min，然后以20℃/min升至200℃，維持2 min；頂空瓶溫度：90℃；定量杯溫度：95℃；傳輸線溫度：100℃；頂空平衡時間：30 min，進樣時間：1.0 min；進樣體積：1 mL。

3.2.2 專屬性

分別精密量取25%DMF、定位溶液、供試品溶液、混合定位溶液各5 mL，頂空進樣，記錄色譜圖，試驗結果如表1所示。

3.2.3 進樣精密度

取對照品溶液1連續進樣6針，頂空進樣，記錄色譜圖，計算甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯峰面積的相對標準偏差RSD，試驗結果如表2所示。結果表明：甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯峰面積的相對標準偏差RSD均小于5.0%，該方法的進樣精密度良好。

3.2.4 檢測限與定量限

分別取甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯定位溶液，并依次稀釋至一定濃度，分別以信噪比S∶N=10∶1及3∶1時的濃度作為定量限及檢測限，試驗結果如表3所示。

3.2.5 線性與范圍

根據定量限結果，配制各成分定量限濃度的混合液；再精密量取0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL的對照品母液1置100 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，作為濃度梯度溶液；精密量取各濃度梯度溶液1.0 mL，分別置10 mL量瓶中，用25%DMF稀釋至刻度，搖勻，作為線性試驗溶液；頂空進樣，記錄色譜圖，以濃度C（μg/mL）為橫坐標，峰面積AS為縱坐標，進行線性回歸，試驗結果如表4所示。

結果表明：在一定濃度范圍內，甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的峰面積與濃度間均呈現良好的線性關系。

3.2.6 重復性試驗

精密稱取本品（160402批）約1.0 g，置于10 mL量瓶中，精密加入1.0 mL對照品貯備液1，用25%DMF稀釋定容，搖勻，作為試驗溶液，平行制備6份。分別精密量取對照品溶液1及供試品溶液5 mL，頂空進樣，按外標法計算各成分含量，試驗結果如表5所示。結果表明：該方法的重復性良好。

表1 專屬性試驗結果

表2 精密度試驗結果

表3 檢測限與定量限試驗結果

表4 線性試驗結果

表5 重復性試驗結果

3.2.7 回收率試驗

精密稱取本品（160402批）9份，每份約1.0 g，分別置于10 mL量瓶中，精密加入1.0 mL 80%、100%、120%三個濃度級別的對照品貯備液1，用25%DMF稀釋定容，搖勻，作為80%、100%、120%試驗溶液，每個濃度級別平行制備3份。精密量取對照品溶液及各濃度級別試驗溶液，頂空進樣，記錄色譜圖，按面積外標法計算并扣除本底，回收率試驗結果如表6所示。結果表明：甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的回收率結果良好，該方法的準確度高。

表6 回收率試驗結果

3.3 供試品測定

依法測定1504011、1504021、1504031、1504012、1504022、1504032、160401、160402、160403、160501共10個批次的尿多酸肽注射液供試品，均未檢測出甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯。

4 苯的研究

4.1 測定法

取對照品溶液2頂空進樣，記錄色譜圖，苯的理論板數不低于5 000；再取供試品溶液頂空進樣，記錄色譜圖，按面積外標法計算苯的含量，含苯不得超過0.000 2%。

4.2 分析方法驗證

4.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-624（30 m×0.32 mm×1.8 μm）；載氣：高純氮氣；分流比：10∶1；恒壓模式：15×6 894.757 Pa；柱溫：初始60 ℃，維持16 min，以20℃/min升至200℃，維持2 min；氣化室溫度：210℃；檢測器溫度：230℃；頂空瓶溫度：90℃；定量杯溫度：95℃；傳輸線溫度：100℃；頂空平衡時間：30 min；進樣時間：1.0 min；進樣體積：1 mL。

4.2.2 專屬性

精密量取25%DMF、定位溶液、混合定位溶液、供試品溶液各5 mL，分別頂空進樣，記錄色譜圖，試驗結果如表7所示。結果表明：甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、乙醇對測定無干擾；苯的理論板數大于5 000。

4.2.3 進樣精密度

取對照品溶液2連續進樣6針，頂空進樣，記錄色譜圖，計算苯峰面積的相對標準偏差RSD，試驗結果如表8所示。結果表明：苯峰面積的RSD小于5.0%，該方法的進樣精密度良好。

4.2.4 檢測限及定量限

取對照品溶液2，稀釋至一定濃度，分別以信噪比S∶N=10∶1及3∶1時的濃度作為定量限及檢測限，試驗結果如表9所示。

4.2.5 線性與范圍

根據定量限結果，配制苯的定量限溶液；分別精密量取0.5 mL、0.8 mL、1.2 mL對照品母液2置100 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，作為濃度梯度溶液；精密量取各濃度梯度溶液1.0 mL，分別置10 mL量瓶中，用25%DMF稀釋至刻度，搖勻，作為線性試驗溶液；頂空進樣，記錄色譜圖，以濃度C（μg/mL）為橫坐標，峰面積As為縱坐標，進行線性回歸，試驗結果如表10所示。

結果表明：在一定濃度范圍內，苯的峰面積與濃度間呈現良好的線性關系。

表7 專屬性試驗結果

表8 進樣精密度試驗結果

表9 檢測限與定量限試驗結果

表10 線性試驗結果

4.2.6 重復性試驗

取本品（160402批）約1.0 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，精密加入1.0 mL對照品貯備液2，用25%DMF稀釋定容，搖勻，作為試驗溶液，平行制備6份。分別精密量取對照品溶液及供試品溶液5 mL，頂空進樣，記錄色譜圖，按面積外標法計算苯的含量，試驗結果如表11所示。

表11 重復性試驗結果

結果表明：該方法的重復性良好。

4.2.7 回收率試驗

精密稱取本品（160402批）9份，每份約1.0 g，分別置于10 mL量瓶中，精密加入1.0 mL 80%、100%、120%三個濃度級別的對照品貯備液2，用25%DMF稀釋定容，搖勻，作為80%、100%、120%試驗溶液，每個濃度級別平行制備3份。精密量取對照品溶液及各濃度級別試驗溶液，頂空進樣，記錄色譜圖，按面積外標法計算并扣除本底，試驗結果如表12所示。

表12 回收率試驗結果

結果表明：苯的回收率結果良好，該方法的準確度高。

4.3 供試品測定

依法測定1504011、1504021、1504031、1504012、1504022、1504032、160401、160402、160403、160501共10個批次的尿多酸肽注射液，均未檢測出苯。

5 結語

尿多酸肽注射液在合成過程中，使用了大孔樹脂吸附工藝，經與樹脂供應廠家溝通，樹脂中可能存在的有害殘留物為苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯等。本文通過對10個批次的尿多酸肽注射液樣品進行檢測，證明該工藝生產的尿多酸肽注射液中不存在大孔樹脂有害殘留物。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：393-394.