一種改良復(fù)蘇法對(duì)人肝星狀細(xì)胞復(fù)蘇效果的實(shí)驗(yàn)研究

楊 丹，謝林浚，胡 慶，羅德蘭，鄧明明

伴隨生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展，細(xì)胞體外培養(yǎng)成功與否以及細(xì)胞生物學(xué)特性的好壞，直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。為阻斷退變，保存種子細(xì)胞，減少細(xì)胞被污染必須及時(shí)凍存細(xì)胞。但是由于不同細(xì)胞對(duì)復(fù)蘇條件要求不同，常規(guī)復(fù)蘇方法不可能適用于所有細(xì)胞，從而導(dǎo)致復(fù)蘇成功率低，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。因此，需要對(duì)肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate Cell, HSC)培養(yǎng)過(guò)程基礎(chǔ)且關(guān)鍵的復(fù)蘇進(jìn)行探討，選擇合適條件使凍存后復(fù)蘇的HSC獲得最佳生物學(xué)特性，以確保后期實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人HSC(LX-2)購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院分子生物學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。選取10代以內(nèi)的代數(shù)相近，凍存前細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)期且密度相近，均采用10%DMSO+90%胎牛血清(FBS)作為凍存液，都保存在液氮當(dāng)中的細(xì)胞作為種子細(xì)胞。主要試劑和儀器：FBS、DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS購(gòu)自GIBCO公司；雙抗、胰酶、DMSO購(gòu)自BestBio公司；CCK-8試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

1.2 HSC復(fù)溫方法 傳統(tǒng)復(fù)溫法：取出凍存細(xì)胞后立即于37 ℃ 水浴快速解凍，1分鐘內(nèi)全部融化。改良復(fù)溫法：取出凍存細(xì)胞后立即于40 ℃水浴中迅速融化至冰晶消失，再轉(zhuǎn)入 37 ℃水浴中快速解凍。

1.3 培養(yǎng)基選擇 傳統(tǒng)培養(yǎng)基法：10%FBS+89%DMEM+1%雙抗(100U/ml 青霉素+l00ug/ml 鏈霉素)。改良培養(yǎng)基法：先使用20%FBS+79%DMEM+1%雙抗培養(yǎng)8h，貼壁后改用10%FBS+89%DMEM+1%雙抗。培養(yǎng)基在使用之前均先置于37 ℃ 水浴箱復(fù)溫。

1.4 離心法 傳統(tǒng)離心法：離心前不加培養(yǎng)基，1000r/min離心5min。改良離心法：離心加培養(yǎng)基，800r/min離心3min。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 A組采用傳統(tǒng)復(fù)溫+傳統(tǒng)培養(yǎng)基+傳統(tǒng)離心，B組采用改良復(fù)溫+改良培養(yǎng)基+改良離心。A組和B組細(xì)胞均置于37 ℃，5% CO2，濕度100%的同一孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法 按照實(shí)驗(yàn)分組復(fù)蘇細(xì)胞。于0h、8h、24h、48h、72h在倒置相差顯微鏡下觀察各組HSC細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，觀察內(nèi)容包括細(xì)胞形態(tài)、是否貼壁、生長(zhǎng)分裂是否旺盛、是否達(dá)到融合等。待各組細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，將細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)72h后，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)處理均應(yīng)用SPSS18.0軟件統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差/(x±S)表示。兩個(gè)樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

0h時(shí)各組細(xì)胞呈圓球形，在光鏡下胞質(zhì)透亮，培養(yǎng)基清亮。8h時(shí)兩組細(xì)胞均開始貼壁，但是A組貼壁差，細(xì)胞呈多角形或梭型，B組貼壁良好，胞體呈卵圓形或不規(guī)則形，常伸出數(shù)個(gè)星狀突起，核仁1-2個(gè)。72h時(shí)A組生長(zhǎng)生長(zhǎng)分裂低下,尚未達(dá)到融合，B組生長(zhǎng)分裂旺盛，達(dá)到融合, 生長(zhǎng)密集單層, 可傳下一代(如圖1所示)。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性時(shí)發(fā)現(xiàn)B組OD值顯著高于A組(P<0.01，如表1所示)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)B組處于S期的細(xì)胞顯著多于A組(P<0.05，如圖2所示)。

A組

B組

A組

B組

表1 CCK-8檢測(cè)HSC增殖活性(χ±S)

3 討 論

細(xì)胞復(fù)蘇的關(guān)鍵在于復(fù)溫速率[1]。復(fù)溫速度過(guò)慢時(shí)，細(xì)胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。且復(fù)溫時(shí)造成的細(xì)胞損傷非常快，往往在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)生。故復(fù)蘇的原則是快速解凍，使細(xì)胞迅速通過(guò)最易受損的-5～0 ℃，避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)，活力受損不大[2]。本實(shí)驗(yàn)采取40℃先溶解凍存細(xì)胞后再維持37℃恒溫復(fù)蘇方法，大大加快了凍存細(xì)胞的解凍，故復(fù)蘇后存活率及活化率明顯高于只采取37℃復(fù)蘇的傳統(tǒng)方法。

血清是細(xì)胞培養(yǎng)基中的重要組成部分，其含有大量生物活性物質(zhì)及生長(zhǎng)因子[3]。不同細(xì)胞株對(duì)血清含量的要求各有不同。血清濃度過(guò)高可能影響培養(yǎng)基的酸堿度，促使細(xì)胞過(guò)早分化，且浪費(fèi)資源[4]。但是血清濃度過(guò)低，細(xì)胞可能因缺乏必要生長(zhǎng)因子導(dǎo)致復(fù)蘇率低。因此細(xì)胞剛接種時(shí)血清濃度需較高，穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)應(yīng)降低。改良培養(yǎng)基法根據(jù)HSC細(xì)胞學(xué)特性以及復(fù)蘇過(guò)程中不同階段的特點(diǎn)采用初始高濃度血清以提高細(xì)胞復(fù)蘇率，穩(wěn)定生長(zhǎng)階段降低培養(yǎng)基血清濃度防止細(xì)胞過(guò)早分化，試驗(yàn)證實(shí)改良培養(yǎng)基法使凍存后復(fù)蘇的HSC獲得最佳生物學(xué)特性。

凍存液多使用DMSO，DMSO作為凍存保護(hù)劑在4℃以上時(shí)就具有細(xì)胞毒性，復(fù)蘇后若不及時(shí)清除可能會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)[5,6]。改良離心法即在復(fù)蘇HSC前離心，并在離心前滴加培養(yǎng)基有助于細(xì)胞盡早接觸培養(yǎng)基環(huán)境，減少細(xì)胞外環(huán)境變化過(guò)速所致的細(xì)胞破裂。我們經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)離心前緩慢滴加培養(yǎng)基同時(shí)輕輕晃動(dòng)離心管較不離心去除冷凍保護(hù)劑和離心前不加入培養(yǎng)基有更高的細(xì)胞復(fù)活率。但是在離心過(guò)程中細(xì)胞即使有血清保護(hù)，仍可能受到機(jī)械剪切傷害。離心機(jī)械剪切傷害與離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間關(guān)系最為密切[7]。傳統(tǒng)方法將細(xì)胞懸液經(jīng)1000r/min離心5min，可能并不適用于HSC。HSC雖然是經(jīng)過(guò)處理后的人HSC，其基因表型較原代HSC已有變化，能夠多次傳代，但是其相對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言仍是極為嬌弱，對(duì)外界抵抗力更差。本實(shí)驗(yàn)采取改良離心法即在離心前緩慢滴加培養(yǎng)基同時(shí)輕輕晃動(dòng)離心管，800r/min離心3min。試驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)了降低離心速率、離心時(shí)間可減少對(duì)HSC的破壞，提高細(xì)胞存活率。

本研究通過(guò)改良復(fù)溫方法、離心方法、培養(yǎng)基這三個(gè)因素對(duì)細(xì)胞復(fù)蘇存活率及細(xì)胞生物活性影響的分析與探究, 建立了一種簡(jiǎn)單可行、穩(wěn)定性高、復(fù)蘇存活率高、可保持細(xì)胞最佳生物學(xué)特性、適用于體外實(shí)驗(yàn)研究的新方法。

[1]韓華, 趙靜, 趙紅偉, 等. 凍存復(fù)蘇對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2016, 25(23):2512-2514.

[2]金晶, 朱玲, 高軍, 等. 三種DNA抽提方法對(duì)新鮮血細(xì)胞及凍血細(xì)胞DNA抽提效能的比較[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 35(1):101-105.

[3]李朦, 劉宏偉,LIMeng, 等. 不同保存方法對(duì)“臨床即用型”脂肪源性干細(xì)胞活性影響的評(píng)估[J]. 中國(guó)美容醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 25(4):100-103.

[4]周尚謙, 沈朗, 李雪媛, 等. 血清限制對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子-1表達(dá)及細(xì)胞侵襲力的影響[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 37(6):774-779.

[5]李中文, 吳濤, 付應(yīng)霄, 等. 低濃度二甲基亞砜保護(hù)SSMC7721細(xì)胞凍存后活力[J]. 中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志, 2016, 25(1):70-74.

[6]劉莉, 唐世剛. 促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素聯(lián)合不同DMSO濃度凍存小鼠肝細(xì)胞的質(zhì)量研究[J]. 肝臟, 2015, 20(11):879-882.

[7]段峰, 關(guān)鍵, 楊紅巖, 等. 機(jī)械離心力對(duì)成骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)通路中Runx-2mRNA的影響[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2014, 18(33):5305-5309.