黑果枸杞外整流鉀離子通道SKOR基因的克隆及表達分析

劉麗萍， 戴逢斌， 張 沖， 田 菊， 陳金煥

（1.北京林業(yè)大學(xué) 林木育種國家工程實驗室，北京100083；2.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)和盛生態(tài)科技研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特011517）

植物中的Shaker家族是迄今為止研究最深入的鉀轉(zhuǎn)運家族之一，被認為在植物鉀離子（K+）吸收以及轉(zhuǎn)運方面起到至關(guān)重要的作用［1－2］。最早報道的擬南芥Arabidopsis thaliana內(nèi)向整流K+通道AKT1屬于Shaker家族，它具有雙親和鉀吸收特性，主要在擬南芥根部表皮細胞和皮層細胞中表達，在擬南芥吸收K+過程中起到關(guān)鍵作用。隨后已陸續(xù)從其他植物中克隆得到該基因，均表現(xiàn)出明顯的組織特異性表達，如OsAKTl主要在水稻Oryza sativa根中表皮和維管組織中表達［3］；ZMK1主要在玉米Zea mays胚芽鞘皮層中表達［4］；SeAKT1在鹽角草Salicornia europaea成苗的根和冠中均有表達， 但在根中表達量略高［5］；GkKT2在三葉期棉花Gossypium hirsutum根、莖、葉和頂芽等各部位均有表達，但在葉中表達量較大［6］等。Shaker通道家族也包括外整流K+通道，但目前針對它的研究較少。SKOR與AKT1在跨膜區(qū)具有很高的同源性，但C端比AKT1多約200個氨基酸及6個錨蛋白重復(fù)基序（ankyrin repeat motif，AR）［7－8］。據(jù)報道［9］：胞內(nèi)K+濃度可以調(diào)節(jié)SKOR活性，而對K+的感受性就是依賴C端結(jié)構(gòu)域部分感應(yīng)細胞內(nèi)外電壓差而實現(xiàn)的，AKT1對于細胞內(nèi)的K+卻沒有響應(yīng)。GAYMARD等［10］首次從擬南芥中克隆到編碼外整流K+通道的基因SKOR，并發(fā)現(xiàn)它在根中柱組織特異表達，且能被脫落酸（ABA）抑制，其介導(dǎo)根細胞中的K+向木質(zhì)部外流的轉(zhuǎn)運。在玉米根皮層及中柱細胞中也檢測到了外整流K+通道，并確定其介導(dǎo)K+從中柱細胞外排到木質(zhì)部汁液中，外整流K+通道基因的這一功能在大麥Hordeum vulgare中也得到了驗證［11－12］。另外，Shaker鉀離子通道的孔結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)氨基酸序列上的組氨基酸殘基高度保守，這決定了其通道活性在很大程度上受細胞內(nèi)外酸堿度調(diào)節(jié)，比如，KAT1活性在細胞膜內(nèi)外低pH值的情況下被激活［13］， SKOR的活性受酸堿度影響較大［14－16］。 小白菜Brassica chinensis花粉質(zhì)膜外整流K+通道受細胞內(nèi)外pH值的影響，從而影響花粉萌發(fā)和花粉管的伸長［17］。黑果枸杞Lycium ruthenicum為茄科Solanaceae枸杞屬Lycium多年生野生鹽生類灌木，主要生長在中國西北青海、新疆、甘肅等地的荒漠地區(qū)，不但具有極強的耐旱、耐鹽堿性，還具有重要的經(jīng)濟價值和藥用價值，在生態(tài)建設(shè)和經(jīng)濟發(fā)展中有巨大的應(yīng)用前景，也是研究多年生植物抗逆機制的優(yōu)良植物材料。已有研究結(jié)果表明［18］：與寧夏枸杞Lycium barbarum相比，黑果枸杞具有更強的耐鹽能力。在鹽分脅迫下，黑果枸杞各器官中鈉離子（Na+）和氯離子（Cl－）相對含量均增加，葉片中積累最多，K+/Na+比均下降，在根中比值比地上部分高。但與寧夏枸杞相比，黑果枸杞各器官中的K+含量下降相對較少，積累的Na+和Cl-含量也相對較少，甚至在450 mmol·L-1氯化鈉高鹽脅迫下，各器官中K+/Na+比下降的幅度仍小于寧夏枸杞，其中葉片組織中K+/Na+比值顯著高于同濃度脅迫下的寧夏枸杞，但與擬南芥等傳統(tǒng)植物相比，黑果枸杞耐鹽堿基因尤其是鉀吸收相關(guān)基因的鑒定未見報道。為進一步深入研究黑果枸杞的耐鹽機制，本研究采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription PCR，RT-PCR）方法克隆了黑果枸杞SKOR基因并分析其序列特征，研究了不同pH值的高鹽環(huán)境對SKOR基因表達豐度的影響，為以后研究外整流K+通道SKOR在黑果枸杞體內(nèi)能否維系高K+/Na+比，進而在提高植株耐鹽性中發(fā)揮重要作用而奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑果枸杞種子采自青海省大格勒鄉(xiāng)，在北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實驗室溫室內(nèi)進行播種培養(yǎng)。具體方法：挑選籽粒飽滿的黑果枸杞種子播種在以m（花卉土）∶m（蛭石）∶m（珍珠巖）=3∶2∶1混合后的穴盤中，每天定時噴施無菌水至發(fā)芽后，配制Hoagland營養(yǎng)液進行澆灌。溫室溫度為（23±2）℃,光照16 h·d－1，空氣相對濕度控制在70%左右。以生長4周的黑果枸杞幼苗為實驗材料。

1.2 總RNA的提取

取4周齡黑果枸杞幼苗的根系，加入液氮研磨至粉末狀。根據(jù)改進的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計法鑒定其完整性和質(zhì)量。

1.3 引物的設(shè)計與合成

利用擬南芥等其他植物的SKOR核苷酸序列在實驗室前期建立的本地黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析，得到1條長度為2 500 bp左右的擬SKOR基因。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的片段利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物 P1（5′-ATGCACATTAATAATGGAGGAG-3′）和 P2（5′-AGTTGATTCATTGTTCAAGTACAA-3′），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成引物后，用于該黑果枸杞擬SKOR基因序列全長的擴增。

1.4 RT-PCR擴增

采用RT-PCR法進行基因克隆，PCR擴增反應(yīng)體系：2×PCR Mix 10 μL，上游引物和下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水7 μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，40個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，10℃保存。PCR產(chǎn)物用體積分數(shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說明書進行目的片段的回收和純化。

1.5 陽性克隆的鑒定與序列分析

將回收的PCR產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化Top10大腸埃希菌Escherichia coli感受態(tài)細胞，在含50 mg·L－1氨芐青霉素的LB固體平板培養(yǎng)基上進行藍白斑陽性克隆篩選，篩選出的陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測序。所測序列的比對分析在DNAMAN 6.0生物軟件上進行，在美國生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）上進行Blast搜索。利用NCBI ORFfinder工具確定基因的開放閱讀框。蛋白質(zhì)親/疏水性預(yù)測用ExPASy網(wǎng)站的在線軟件ProtScale分析，以Hphob.Kyte&Doolittle為默認值。進化樹分析先使用Clustal X 2.1軟件對來自番茄Solanum lycopersicum，馬鈴薯Solanum tuberosum，胡楊Populus euphratica等物種的SKOR成員進行序列比對，然后使用MEGA 5.1 Beta 3軟件用鄰接法構(gòu)建。

1.6 基因表達分析

對 4 周齡的黑果枸杞苗分別用 300 mmol·L－1氯化鈉與 450 mmol·L－1碳酸氫鈉（pH 9.0）處理 6 h， 利用天根生化科技有限公司Real Master Mix（SYBR Green）PCR試劑盒，采用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）法，檢測LrSKOR基因的相對表達量。擴增目標LrSKOR基因引物設(shè)計為LrSKOR-F:5′-ATGCACATTAATAATGGAGGAG-3′和 LrSKOR-R:5′-AGTTGATTCATTGTTCAAGTACAA-3′；以黑果枸杞延伸因子 1α基因 EF1α［19］作為內(nèi)參基因，其引物為 EF1αF:5′-GAAGGGTGTCCCTCA GATCA-3′和 EF1α R:5′-CCGTCC ATGTCGTCTCTTTT-3′， 對反轉(zhuǎn)錄所得的 cDNA 按照 1， 1/10， 1/100，1/1 000，1/10 000進行稀釋，繪制相對標準曲線。實時熒光定量設(shè)置反應(yīng)程序為：94℃2 min，94℃20 s，55℃30 s，72℃ 30 s，設(shè)置36個循環(huán)，各輪循環(huán)第3步進行熒光采集，最后 95℃變性 1 min，退火至55℃。根據(jù)熒光值，繪制熔點曲線。內(nèi)參基因的表達與LrSKOR基因按照同樣的反應(yīng)程序同時測試。獨立提取3次待測樣品的RNA作為生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置技術(shù)性重復(fù)3次·樣品－1。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取及LrSKOR基因的克隆及鑒定

取生長4周的黑果枸杞幼苗根部作為實驗材料，提取總RNA，凝膠電泳檢測結(jié)果顯示28 S RNA條帶亮度約為18 S RNA的2倍，表明所提取的黑果枸杞總RNA完整性較好。進一步用紫外分光光度計檢測得出D（260）/D（280）為2.1，說明所提取的RNA純度較好，可用于進一步實驗。

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到第1鏈cDNA后，以該cDNA為模板，以擬SKOR基因的引物P1和P2進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)亮帶，且上下無雜帶，與預(yù)期片段大小一致，推測可能是目的基因。將連接有純化目的片段的PMD18-T克隆載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Top10后，從轉(zhuǎn)化的平板上隨機挑取6個白色菌斑振搖過夜培養(yǎng)，進行PCR擴增，得到的擴增條帶大小與RT-PCR結(jié)果一致，表明這些克隆為陽性克隆。

2.2 核酸序列及基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

將PCR產(chǎn)物進行測序，Genebank登錄號為KY563342。測序所得到的SKOR基因序列全長為2 448 bp，包括1個完整的開放閱讀框，其編碼的SKOR蛋白包含815個氨基酸殘基。在NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast序列比對分析結(jié)果顯示，該基因序列與擬南芥（NM_111153.3），葡萄Vitis vinifera（AJ490336），蓖麻Ricinus communis（XM_002533405）和胡楊（EU382997.1）等植物外整流K+通道基因的核苷酸序列的同源性均在65%以上，其中與葡萄推測的外整流K+通道基因的核苷酸序列的同源性達到70.36%；通過和茄科植物馬鈴薯（XM_006352418.2）， 番茄（XM_004250158.3）， 甜辣椒 Capsicum annuum（XM_016696732.1）等比對同源性很高，其中與馬鈴薯全長同源性最高，達到90.31%，表明本研究已克隆到外整流K+通道基因全長，將其命名為LrSKOR。用ExPASy網(wǎng)站分析該蛋白的理化性質(zhì)，得到其相對分子量約為9.33×104，理論等電點為6.32，其中數(shù)量最豐富的氨基酸依次是亮氨酸（Leu），異亮氨酸（Ile）和絲氨酸（Ser），分別占11.2%，8.6%和7.2%，色氨酸（Trp）含量最少，只占1.2%。

2.3 蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測和親/疏水性分析

利用NCBI網(wǎng)站Conserved Domain工具對LrSKOR氨基酸結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測。結(jié)果表明：LrSKOR蛋白序列在258～315位存在1個與離子通道Ion_trans_2相似的保守結(jié)構(gòu)域，Ion_trans_2是Ion_trans_2超家族的一個成員。在561～716和741～810氨基酸序列位點還分別存在1個與K+運輸有關(guān)的離子通道的錨蛋白區(qū)（ANK）和KHA（鉀離子通道的四聚化結(jié)構(gòu)域），KHA在植物中一般位于C末端區(qū)。

運用ExPASy網(wǎng)站的在線分析軟件ProtScale，以Hphob.Kyte&Doolittle為默認值對LrSKOR編碼的蛋白質(zhì)進行親/疏水性預(yù)測，得到LrSKOR的親／疏水信號圖。疏水性分析結(jié)果表明：LrSKOR編碼蛋白多肽鏈的第113號位點的纈氨酸（Val）疏水性最強，具有最高的分值3.167；第321號的精氨酸（Arg）親水性最強，具有最低的分值－2.956。從整個肽鏈上氨基酸分布來看，親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，且多于疏水性氨基酸，認為該蛋白是親水性蛋白（圖1）。

圖1 LrSKOR蛋白親水／疏水性分析Figure 1 Hydrophobicity/phdrophilicity prediction of LrSKOR protein

用DNAMAN 6.0軟件對LrSKOR的氨基酸全長序列與多種植物SKOR的氨基酸序列進行多序列比對。結(jié)果表明：黑果枸杞LrSKOR與茄科植物甜辣椒、馬鈴薯、番茄等的外整流K+通道的親緣關(guān)系非常近，氨基酸同源性高達90%以上，分別為90.05%，90.70%和90.47%；與擬南芥AtSKOR，苜蓿Medicago truncatula的MtSKOR，玉米的ZmZORK等的親緣關(guān)系相對較遠，同源性為62.36%～69.12%（圖 2）。

為了分析黑果枸杞與其他植物中的SKOR系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系，利用MEGA 5.1 Beta 3軟件對黑果枸杞LrSKOR與茄科及其他物種的蛋白氨基酸序列構(gòu)建了進化樹。由圖3進化樹可知：黑果枸杞與茄科植物如番茄、馬鈴薯、甜辣椒等聚在一起，表明它們之間親緣關(guān)系較近，而與胡楊、蓖麻、玉米等分類在不同分支上，表示它們之間進化關(guān)系相對較遠。

2.4 鹽分脅迫下LrSKOR基因的表達分析

由于LrSKOR基因可能參與調(diào)節(jié)黑果枸杞根部的離子選擇性吸收，本研究提取黑果枸杞根部總RNA，用熒光定量PCR法研究了該基因在高鹽和鹽堿不同脅迫下的誘導(dǎo)表達情況，以EF1α在根中的表達量定為 “1”。按照相對定量公式 2-△△Ct作圖（圖4）。可以看出，LrSKOR基因在對照、高鹽脅迫以及鹽堿脅迫下均有表達。高鹽和鹽堿脅迫下的表達量明顯高于對照，在鹽堿脅迫下的表達豐度最高，是高鹽處理的6.81倍，是對照的23.79倍。這表明LrSKOR基因參與高鹽及鹽堿環(huán)境脅迫響應(yīng)，并且與環(huán)境pH值之間可能存在較為緊密的關(guān)系。

3 討論

圖2 LrSKOR與其他植物SKOR開放閱讀框氨基酸的多序列比對Figure 2 Amino sequence alignment of LrSKOR with other plants SKOR

植物體內(nèi)豐富的K+主要由植物根部從土壤中吸收而獲得。研究表明［19］：根部吸收K+后經(jīng)木質(zhì)部裝載，在蒸騰拉力作用下，隨木質(zhì)部流入地上部完成K+在地上部分的積累，外整流K+通道在此運輸過程中發(fā)揮重要作用。目前，有關(guān)模式植物擬南芥的外整流K+通道蛋白的研究最為集中，而其他植物的外整流K+通道蛋白的研究還較少。GAYMARD等［10］從擬南芥中分離得到K+外整流通道蛋白基因AtSKOR，通過非洲爪蟾Xenopus laevis卵母細胞異源表達和突變體atskor試驗證明，AtSKOR介導(dǎo)K+從木質(zhì)部薄壁細胞向木質(zhì)部的裝載。沙冬青Ammopiptanthus mongolicus保衛(wèi)細胞外整流K+通道AmGORK也被克隆，其活性與擬南芥SKOR一樣對細胞外pH值很敏感，在2個pH單元的酸化程度下活性被降低了70%［20］。另有研究認為，鹽分脅迫下的外整流K+通道蛋白SKOR可能是唯一對木質(zhì)部汁液中鉀分泌起作用的Shaker K+通道，它的活性可由木質(zhì)部薄壁細胞中Na+不斷積累引起的薄壁細胞質(zhì)膜去極化而被激活，進而將 K+裝載到木質(zhì)部運往地上部芽［21－22］。 木本植物霸王Zygophyllum xanthoxylum的ZxSKOR研究表明［23］：ZxSKOR主要在根和莖中表達，且其表達水平隨葉片中K+的濃度增加而顯著提高，并認為鹽分脅迫下，根和莖中的ZxSKOR相互協(xié)調(diào)很好地起到對K+的長距離運輸?shù)淖饔谩Ｒ虼耍琒KOR在植物地上部分K+積累方面的作用不容忽視，但關(guān)于它是如何參與K+向木質(zhì)部的運輸還沒有明確的證據(jù)。WANG等［24］在小花堿茅Puccinellia tenuiflora中的研究證明，其地上部分K+的含量不受外界鹽分濃度及處理時間的影響，這是小花堿茅維持植株地上部高K+/Na+比的重要原因之一。目前，已克隆得到小花堿茅的外整流K+通道PtSKOR基因片段［25］，這將為進一步研究小花堿茅耐鹽機理奠定基礎(chǔ)。關(guān)于黑果枸杞耐鹽生理生態(tài)機制的研究結(jié)果表明，Na+和K+主要分布在黑果枸杞地上部分，但根中K+/Na+比值比葉片中高，與其他積鹽鹽生植物鹽爪爪Kalidium foliatum和白刺Nitraria tangutorum相比，黑果枸杞的K+/Na+比值高于這兩者，從而表現(xiàn)出相對較強的耐鹽能力［26］，由此看出，K+的積累和運輸在表現(xiàn)黑果枸杞耐鹽性方面扮演及其重要的角色，但目前關(guān)于黑果枸杞K+積累與運輸?shù)姆肿訖C制尚不清楚。

圖3 LrSKOR與其他植物SKOR的系統(tǒng)進化樹Figure 3 Phylogenetic analysis of LrSKOR with SKOR from different plant species

圖4 LrSKOR在不同pH值鹽分脅迫下的表達分析Figure 4 Expression level under salt treatment of different pH values

黑果枸杞作為沙漠中可以建群的多年生灌木，具有很強的抗鹽堿能力，加上繁殖力強的特點，有望成為耐鹽堿研究的模式植物。近年來，黑果枸杞耐鹽堿研究日益受到關(guān)注，本研究以前期測的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，從黑果枸杞根系中成功克隆得到SKOR基因。研究已知，SKOR屬于鉀轉(zhuǎn)運蛋白中的Shaker家族，典型的植物Shaker通道蛋白從N末端至C末端包括一個大約由60個氨基酸組成的細胞質(zhì)N末端區(qū)、由6個跨膜區(qū)構(gòu)成的疏水核和一個很長序列的細胞質(zhì)C末端區(qū)。其中，C末端區(qū)含有調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，包括一個推測的環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)（CNBD）、一個存在于大部分Shaker通道中的錨蛋白區(qū)和一個靠近C末端的富含疏水酸性殘基區(qū)（KHA）［27］。本研究對該基因編碼的蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其分別存在一個錨蛋白區(qū)和KHA四聚化保守結(jié)構(gòu)域，說明該基因編碼的蛋白屬于與K+運輸有關(guān)的Shaker家族蛋白。Shaker通道的一個重要特點是能形成異源四聚體結(jié)構(gòu)，KHA是鉀離子通道蛋白的四聚化結(jié)構(gòu)域，可能參與了這個過程，從而使該蛋白起到調(diào)節(jié)細胞中的K+轉(zhuǎn)運活性的功能；錨蛋白結(jié)合位點可使該蛋白質(zhì)特異地定位在質(zhì)膜上，并潛在地影響蛋白與蛋白之間的相互作用。通過對LrSKOR編碼氨基酸同源性序列比對和系統(tǒng)發(fā)育進化分析，得出LrSKOR與擬南芥、胡楊、蓖麻等雙子葉植物的外整流K+通道相比同源性較低，但與茄科植物如馬鈴薯、番茄等同源性達90%以上，構(gòu)建進化樹中聚在一起（圖2），這表明黑果枸杞與其他茄科植物SKOR蛋白進化程度相似，LrSKOR同樣行使推測的參與K+向木質(zhì)部運輸?shù)墓δ埽舱f明了黑果枸杞與其他茄科植物存在較近的親緣關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)，LrSKOR在鹽堿脅迫下的表達豐度最高，高鹽脅迫下次之，對照最低。這表明，黑果枸杞LrSKOR作為外整流K+通道，其基因表達除了受鹽分脅迫影響外，與土壤pH值還存在密切的聯(lián)系，這與很多前人研究的推論相一致。因此，LrSKOR很可能在黑果枸杞耐鹽性發(fā)揮方面具有重要作用。這也為進一步闡明鹽生植物黑果枸杞K+和Na+選擇性運輸機制提供分子層面的依據(jù)，具有重大的研究價值及應(yīng)用前景。

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