淺談細(xì)菌素Nisin

□ 張雪穎 蘇州大學(xué)劍橋-蘇大基因組資源中心

Nisin 是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的I類細(xì)菌素，由于它能有效地抑制或滅活腐敗菌和食源性病原菌而被廣泛應(yīng)用于食品中。本文對Nisin 滅菌機(jī)制、調(diào)控及分離純化進(jìn)行簡單介紹。

Nisin是已知的最古老和最具特征的硫醚抗生素，于1928首次被發(fā)現(xiàn)，并于1969批準(zhǔn)用于食品工業(yè)。由于它能有效地抑制或滅活腐敗菌和食源性病原菌，已有50多個(gè)國家被許可用作食品防腐劑。Nisin 由乳酸鏈球菌產(chǎn)出，是一種具有正電荷的34個(gè)氨基酸肽，其線狀結(jié)構(gòu)由五個(gè)內(nèi)環(huán)和一個(gè)靈活的中樞區(qū)域組成。

Nisin的滲透細(xì)胞膜的機(jī)理是通過兩種不同的途徑實(shí)現(xiàn)的。一種理論是通過孔隙形成機(jī)制。Nisin通過結(jié)合一種細(xì)菌細(xì)胞被生物合成所必需的細(xì)胞膜前體，即脂類II，來連接細(xì)菌細(xì)胞 質(zhì) 膜（Cytoplasma Membrane，CM）。當(dāng)幾個(gè)Nisin分子聚集在一起時(shí)，就會在CM中形成孔隙。第二種理論是低親和力滲透機(jī)理。與負(fù)電荷的細(xì)菌磷脂結(jié)合后，Nisin進(jìn)入磷脂的親水基之間，多個(gè)Nisin單體聚集在外層的脂質(zhì)單層中，形成一個(gè)短壽命的類孔結(jié)構(gòu)，使它能夠跨越脂質(zhì)雙層。這兩種機(jī)制均能改變CM的形成，抑制靶細(xì)胞細(xì)胞壁的合成，從而抑制細(xì)胞的生長。一些革蘭氏陽性菌，如乳球菌、乳桿菌、皮球菌、微球菌、葡萄球菌和李斯特菌都對Nisin敏感。此外，Nisin也可以防止或抑制芽孢桿菌和梭菌的內(nèi)孢子生長和營養(yǎng)生長。由于革蘭氏陰性菌外模的滲透屏障，使得Nisin對革蘭氏陰性菌沒有抗性。

靶細(xì)胞的一些因素，如細(xì)胞磷脂含量低、膜脂肪酸組成改變、細(xì)胞壁組成變化等，能夠影響Nisin的活性。此外，結(jié)合在細(xì)胞壁上的負(fù)電荷多糖可提高靶細(xì)胞對Nisin的抗性。

Nisin生物合成的調(diào)控

11個(gè)基因組成的基因簇，即nisABTCIPRKFEG，參與了Nisin的生物合成。基因nisA編碼nisin A前體肽；基因nisB和nisC參與翻譯后修飾反應(yīng)；基因nisT參與前體nisin的易位；基因nisP參與前體加工；基因nisI和nisFEG分別參與nisin的自我保護(hù)和免疫；基因nisR和nisK參與了nisin生物合成的調(diào)控。

Nisin本身作為信號分子生物，合成受群體感應(yīng)調(diào)控。在nisin生物合成的自調(diào)控過程中，兩組調(diào)控系統(tǒng)，即nisK和nisR，在nisin的轉(zhuǎn)錄激活和下游生產(chǎn)中起著重要的作用。作為一種傳感器組氨酸激酶，NisK能感覺到nisin和自磷酸化酸鹽的存在。磷酸化后，磷酸鹽基轉(zhuǎn)移到反應(yīng)調(diào)節(jié)劑NisR中，誘導(dǎo)nisA和nisF啟動子的激活，從而合成未經(jīng)修飾的前體nisin。未經(jīng)修飾的前體nisin由假定的酶NisB和NisC修飾，然后通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體NisT跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。通過NisP對前體nisin進(jìn)行修飾后，nisin被激活并釋放。此外，NisIFEG還共同作用以防止nisin的殺菌作用對自身細(xì)胞的破壞，從而確保對宿主細(xì)胞的免疫力。

Nisin的分離純化

從食物和食品中分離Nisin的方法包含篩選乳酸菌的抗菌活性，并將得到的抗菌物質(zhì)進(jìn)一步分離和確定，以便確定為細(xì)菌素。一般采用軟瓊脂（0.75%）覆蓋法分離細(xì)菌素。為了排除過氧化氫產(chǎn)生抑制的可能性，在培養(yǎng)基中加入過氧化氫酶；在固體瓊脂中加入碳酸鹽或磷酸鹽緩沖液，以避免有機(jī)酸的拮抗作用。噬菌體所造成的抑制作用也可以通過排除在帶有敏感指標(biāo)的瓊脂上缺乏噬菌體菌斑而確定。這種抑制活性是通過spot-onlawn方法或在帶有敏感指示物的瓊脂平板上進(jìn)行擴(kuò)散試驗(yàn)來檢測和證實(shí)的。

Nisin是在培養(yǎng)基中分泌的蛋白質(zhì)類化合物。在純化前，nisin需要從產(chǎn)生的培養(yǎng)物的無細(xì)胞上清液中濃縮。通常，采用硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)和用丁醇、乙醇等有機(jī)醇提取蛋白質(zhì)的方法來選擇性地提取nisin。然后，通過陽離子交換、凝膠過濾、疏水作用和反相液相色譜等幾個(gè)色譜步驟純化細(xì)菌素。純化細(xì)菌素的產(chǎn)量往往很低，可能是由于提純步驟過多導(dǎo)致的。因此，優(yōu)化細(xì)菌素的產(chǎn)生是實(shí)現(xiàn)細(xì)菌素濃度最大化的重要步驟。

含nisin的食品生物保存

Nisin由乳酸菌（L.lactis）產(chǎn)生，是唯一獲準(zhǔn)用于某些加工奶酪、乳制品和罐頭食品中的食品防腐劑的細(xì)菌素。在食品中添加nisin可以通過減少化學(xué)防腐劑的使用和/或熱處理強(qiáng)度來提高加工產(chǎn)品的感官和營養(yǎng)特性。大多數(shù)情況下，乳酸菌細(xì)菌素與傳統(tǒng)和新的保存方法（例如高壓處理和脈沖電場）共同作用，以滅活目標(biāo)腐敗菌或致病菌。這些組合之所以有效，是因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞受到更嚴(yán)重的損害，在聯(lián)合治療后可能需要更多的能量來修復(fù)損傷，導(dǎo)致能量耗盡和細(xì)胞死亡。因此，食物的衛(wèi)生質(zhì)量得到改善，保質(zhì)期得到延長。