外泌體在膠質瘤中的研究進展

李晨龍，王斯文，侯偉良，鄭宏山，梁 鵬 （哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院神經外科，黑龍江哈爾濱150001）

0 引言

膠質瘤來自神經膠質細胞或神經膠質前體細胞，是惡性程度最高的腦腫瘤［1］。根據CBTRUS統計數據顯示，膠質瘤的發病率約占中樞神經系統腫瘤的32%，且約占原發惡性腫瘤的80%［2］。膠質母細胞瘤是致死率最高的原發惡性腦腫瘤，其中位生存期約為14.6個月［3］，臨床上常用的治療方案包括手術切除及術后同步的放化療［4］。因膠質瘤母細胞瘤具有浸潤性生長的特點，使其難以全部切除，因此，膠質瘤的治療成為醫學界的一大難點。

腫瘤細胞之間可以通過腫瘤微環境進行通訊，進而影響周邊細胞的生物學行為。膠質瘤細胞之間可以利用各種細胞分泌因子，達到細胞間通訊的目的，而包裹這些相關分泌因子的結構被稱為細胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）。 EVs是一類無細胞器的細胞基質，封閉在球形脂質雙層分子中，并且依據其來源及體積進行分類。來自多泡體（multi-vesicular bodies，MVBs）的囊泡常被稱作外泌體，因其直接由細胞質膜生成，又稱作細胞微泡［5］。細胞在處于外界壓力或死亡狀態，以及凋亡小體引起的胞膜空泡化過程中，可以向微環境中排出一些物質［5］。很明顯，外泌體作為一種獨特的結構參與了一系列重要的生理過程，包括細胞間的蛋白質和RNA交換，誘導血管生成等［6-8］。目前，外泌體在膠質瘤中發揮作用的具體機制尚不清楚。

1 外泌體的生物學特性

1.1 外泌體的構成外泌體的直徑為40～120 nm，可以通過100 000 rpm／min離心得到（在蔗糖梯度中浮力密度在 1.13 ～ 1.19 g／mL）［9］。 通過電子顯微鏡觀察顯示外泌體為球狀的脂質雙層結構［10］。其含水內核或脂質膜內部含有多種蛋白質、核酸以及細胞因子，其組成由分泌的細胞來源決定［2，9］。

目前已發現多種外泌體相關蛋白，但其核心組成尚不明確。研究［11］發現，在融合進入細胞與囊泡出芽過程中，脂類在維持細胞膜硬度和穩定性中發揮著重要作用。外泌體含有的脂類成分復雜，據報道［12-13］有多種脂類成分存在于外泌體的脂質雙層結構中，包括類固醇、鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷酯酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、神經節苷脂GM3和前列腺素等物質。并且，外泌體中還具有多種功能的細胞膜相關蛋白，包括粘附分子和四跨膜蛋白超家族（CD9、CD63、CD81、CD82），ICAM-1和整合素，細胞內運輸和細胞膜融合相關（Rab蛋白，鈣磷脂結合蛋白），MVB形成相關蛋白（Alix， TSG101）［14］，其他可能存在的蛋白主要由細胞類型以及分離的方式決定。

1.2 外泌體與膠質瘤相關性膠質母細胞瘤患者術后出現腫瘤復發，主要與腫瘤侵襲性生長的特性有關，有研究［15-17］顯示一些具有高侵襲性和轉移性的腫瘤細胞具有形成侵襲性偽足的特征。而由細胞粘附因子、細胞內信號途徑、配體以及肌動蛋白調節蛋白構成了復雜的網絡，共同發揮水解侵襲性偽足的功能［18］。 有研究［19］發現外泌體可以和侵襲性偽足發揮協作關系，改變或者降解周圍的細胞外基質，促進腫瘤細胞的侵襲。并且，外泌體可以通過改變周圍支持細胞的生物學表型，促進腫瘤細胞增殖和侵襲的微環境。而在細胞中加入間質細胞來源的外泌體，進行共培養后，發現其具有促進腫瘤細胞增殖的能力，研究［20］發現其不僅可以影響腦部正常的支持細胞（星形膠質細胞），還可以使膠質母細胞瘤的其他亞型發生表型的改變。因此，細胞間的外泌體轉運機制可以作為研究膠質母細胞瘤生物起源和細胞發展的潛在作用因素。

外泌體是腫瘤細胞分泌的代謝產物、生長因子、離子和細胞因子等復雜物質的延伸［16］。既往研究［15-17，21］已確定外泌體可以介導組蛋白、致癌因子（EGFRvIII）、miRNA 以及腫瘤抑制因子（PTEN）在膠質瘤中的轉運。膠質瘤細胞分泌的外泌體參與了腫瘤微環境的形成，包括功能性RNA的轉錄、血管生成、克隆形成能力，以及旁分泌途徑誘導的增殖能力增強、免疫耐受能力或誘導正常細胞的惡性轉變的過程有關［22-25］。并且，膠質瘤來源的外泌體可以改變細胞表面蛋白的表達和細胞因子的分泌，并同時可以通過改變免疫細胞的吞噬能力影響腫瘤微環境中的免疫功能［20，26］。

2 基于外泌體的診斷

2.1 膠質瘤分泌外泌體的可檢測性膠質瘤的異質性特征使得患者的生存期各不相同，因此，需要更多的可以監控疾病進展和治療反應的方法。而檢測外泌體中含有的功能性分子標志物具有一定意義，通過收集含有患者外泌體的液體活檢標本，以微創的方式監控疾病的進展，可以使膠質瘤患者診斷和個性化治療方案發生深刻的變革［27］。在膠質瘤的診斷中，結合外泌體中標志物的檢測方法可以補充現有的組織活檢病理學和MRI診斷方式的不足，有助于對患者的腫瘤進展進行監控。并且液體活檢外泌體中分子標志物的方法具有創傷小、可靠性強的特點。通過分離腫瘤細胞分泌的外泌體并進行富集，與健康人群循環系統中外泌體中所含有的分子進行比較，得到差異表達分子［28］。

目前已經可以從膠質瘤患者血液樣本和腦脊液中分離外泌體，其中包含腦腫瘤細胞來源的蛋白、脂類、RNA和DNA。提示基于膠質瘤來源的外泌體是可以離開腦實質并進入外周循環［9］。隨后通過使用多種方法分離外泌體，包括超速離心及過濾法，或抗體聚集法，將外泌體從患者的體液樣本中分離出來。而相對于既往腫瘤活檢或切除這種高度侵襲性的取材方式，生物體液樣本的外泌體分離可以在患者的整個治療過程中多次進行［29］，更具有腫瘤進展檢測的意義。

2.2 膠質瘤分泌外泌體的腫瘤特異性腫瘤細胞分泌的外泌體中富含腫瘤特異性分子，相比腫瘤細胞內含量高出近百倍。而腦脊液是外泌體研究中最具有吸引力的，因為腦脊液避開了血腦屏障對胞外囊泡濃度的限制，可以輕松穿越進入外周循環。腦脊液相對于血液循環來源非腫瘤細胞的外泌體或血小板來源的微粒相比，具有“雜質”少的特點［30］。

目前已有一些細胞核外RNA被確認為膠質瘤特異性生物標志物，包括突變型EGFRvIII、IDH1和miR-21［31］。收集膠質瘤患者腦脊液中外泌體后發現，細胞核外野生型EGFR表達水平與化療反應存在相關性，并且可以作為膠質瘤患者藥物敏感性的潛在生物標志物，如高達70%的膠質母細胞瘤患者中存在EGFR 過表達［32-33］。 并且，研究［34］顯示 EGFRvIII 的表達與膠質母細胞瘤的傳統分子亞型存在相關性，通過檢測外泌體EGFRvIII的表達水平，可以為患者制定個體化治療［35］。通過使用免疫磁性外泌體（iMER）技術檢測標志物EPHA2，可使膠質瘤組織的識別率達84.4%，檢測EGFR可達78.1%，而通過聯合檢測這兩種標志物，可使膠質瘤組織的總體檢測正確率達到90%［36］。研究已知 miR-21可以調節 EGFR的表達，并且已在100%的膠質瘤患者的腦脊液中檢測到，提示miR-21為檢測膠質瘤的一種高度敏感的標志物，并且實驗證實與腫瘤轉移的微環境的調控有關［37］。由于IDH1突變與原神經分子亞型相關，已有研究證實其突變與良好的臨床預后相關［36，38］。

2.3 外泌體作為化療耐藥標志物的研究外泌體可以作為腫瘤化療的敏感性依據，甲基鳥嘌呤甲基轉移酶（MGMT）在替莫唑胺治療膠質瘤過程中可以發揮修復損傷的DNA雙鏈的作用。在膠質瘤患者中，MGMT啟動子DNA甲基化上調可以減少細胞中特定核蛋白的表達，通過對患者的血清進行iMER檢測發現，對于耐藥人群，在接受莫唑胺治療后，其外泌體mRNA表達水平升高［38］。此外，miR-603和miR-181d的表達水平改變同樣與MGMT表達水平相關［39］。由于外泌體MGMT的mRNA水平是可進行檢測的，因此可在治療期間對患者的化療反應進行監測。

3 基于外泌體的治療

3.1 抑制外泌體生成、吸收和分泌已有證據顯示外泌體在膠質瘤的生物進程中發揮了重要作用，靶向外泌體介導的細胞間相互作用的治療成為了一個新的治療領域。通過使用外泌體生成抑制劑可以影響細胞的炎癥反應，減輕細胞內的囊泡形成［40］。Rab GTP酶被公認為人類疾病的重要靶點，其自身發生突變或者表達下調均可引起一系列疾病的發生［41］。借助于外泌體調節細胞膜的物質交換，Rab GTP酶在細胞信號傳遞和外部刺激的反應中發揮重要作用。而抑制Rab27a的表達可以在體內和體外實驗中減少癌癥促進性外泌體的釋放，抑制原位腫瘤的生長和遠處轉移［42］。

3.2 外泌體藥物靶向投遞系統由于外泌體具有較長的循環半衰期，內在的靶向受體腫瘤細胞能力，生物相容性和低毒性等良好特性，因此可以構建成為理想的藥物投遞系統［43］。最近，來自于內皮細胞的外泌體被應用于投遞紫杉醇和阿霉素跨越血腦屏障進入腦部發揮作用，抑制了腫瘤的生長［44］，顯示了外泌體治療的優勢。在小鼠模型中發現，通過工程改造來自樹突狀細胞，表達一定數目膜蛋白的外泌體，成功地穿越血腦屏障進行siRNA投遞。

3.3 外泌體與 miRNAGallo 等［45］通過檢測全血、尿液、唾液、腦脊液和外泌體中的miRNA水平后，發現絕大多數細胞外miRNA實際上存在于外泌體中。外泌體包裹RNA后可以保護其免受細胞外RNA酶的降解，而外泌體則扮演了細胞間miRNA搬運工的角色，從而調節細胞內mRNA的翻譯［46］。目前尚無法確認所有的外泌體中均含有RNA，但是一些研究顯示腫瘤來源的外泌體可能還由與親代細胞不同的RNA組成［47-59］。并且，外泌體釋放進入細胞外環境時，其中含有的RNA的選擇和包裝的機制目前尚未研究清楚［51］。

4 展望

目前已知外泌體和其他細胞外囊泡可以通過傳遞多種分子和物質用于供體和受體細胞之間的遠距離通訊。并且越來越多的研究顯示外泌體可以參與多種腫瘤的生物學過程，而腫瘤細胞分泌的外泌體不僅存在于腫瘤的進展過程，也同樣應用于周邊微環境的修飾，最終積極地改變了腫瘤的微環境，使腫瘤細胞存活下來。目前對于膠質瘤外泌體研究領域，還需進行更多深入的研究：包括優化分離技術、膠質瘤相關外泌體的特征研究和外泌體標志物的檢測方法，最終可以使外泌體的投遞成為診斷、預后和靶向治療的潛在作用靶點，減少膠質瘤治療時的脫靶效應，提高患者生存期，從而有望成為臨床治療膠質瘤的一個突破點。