晾曬煙調(diào)制過程中酶促棕色化反應(yīng)及調(diào)控方法

李秀妮 ，喬保民 ，吳 創(chuàng) ，田煜利 ，萬德建 ，時向東

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南鄭州450002；2.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北恩施445000）

酶促棕色化反應(yīng)是一系列復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，在晾曬煙的調(diào)制過程中，煙葉因饑餓代謝而消耗大量的內(nèi)含物質(zhì)，因此，外觀顏色會隨調(diào)制的進(jìn)行不斷發(fā)生改變，其顏色的變化為“淡綠—黃綠—淡黃—正黃—深黃—棕色—褐色”[1]。Akaike等[2]對日本煙草var.Shirodaruma在晾制過程中色素的變化進(jìn)行了研究，在由綠變黃階段，顏色發(fā)生變化的實質(zhì)原因是在葉綠素的降解作用下發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)所致。適當(dāng)促進(jìn)酶促棕色化反應(yīng)的進(jìn)行，將有利于晾曬煙品質(zhì)的提升，但若環(huán)境溫濕度條件或煙葉失水速率控制不當(dāng)，就極易使酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生過度，導(dǎo)致晾曬煙發(fā)黑、霉變、甚至腐爛，嚴(yán)重影響煙葉的外觀質(zhì)量和抽吸品質(zhì)[3]。因此，如何調(diào)控酶促棕色化反應(yīng)的進(jìn)行對晾曬煙調(diào)制具有重要意義。

1 酶促棕色化反應(yīng)的過程與本質(zhì)

1.1 酶促棕色化反應(yīng)過程

國外對酶促棕色化反應(yīng)的研究始于20世紀(jì)70年代，國內(nèi)開始于20世紀(jì)80年代，目前已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展[4]。酶促棕色化反應(yīng)主要發(fā)生在煙葉變黃末期至調(diào)制結(jié)束這一過程中。當(dāng)調(diào)制進(jìn)行至變黃末期，原本束縛于細(xì)胞內(nèi)的氧化酶類隨著葉肉組織逐漸死亡，細(xì)胞膜系統(tǒng)透性逐漸增大而滲入細(xì)胞間隙中，從而與細(xì)胞間隙內(nèi)的多酚類物質(zhì)發(fā)生直接接觸，生成大量醌類物質(zhì)。同時，細(xì)胞膜系統(tǒng)透性的增大使活性氧能自由進(jìn)出煙葉組織，促使葉片內(nèi)氧化酶（特別是多酚氧化酶PPO）的活性增強(qiáng)，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)多酚類物質(zhì)的氧化[5－6]，葉片內(nèi)最終物質(zhì)的氧化還原平衡被破壞，醌類物質(zhì)大量生成和聚合使煙葉顏色加深[7]。

1.2 酶促棕色化反應(yīng)本質(zhì)

Matheis等[8]研究表明，植物組織中的酚、酶一經(jīng)接觸，將會發(fā)生一系列反應(yīng)。首先一元酚經(jīng)甲酚酶催化生成鄰－二羥基化合物，然后在多酚氧化酶的催化作用下，鄰－二酚被氧化成鄰－本醌，最后鄰－本醌繼續(xù)變化，生成高分子聚合物。此外，氨基酸或蛋白質(zhì)與鄰－苯酚作用生成高分子的絡(luò)合物，這些物質(zhì)會導(dǎo)致褐色素的生成。例如，在晾曬煙調(diào)制和發(fā)酵過程中兒茶酚棕色化反應(yīng)就是煙葉變褐的重要過程[9]。在這個過程中，首先兒茶酚在多酚氧化酶作用下氧化成鄰醌，隨后鄰醌或沒有氧化的兒茶酚在酚羥化酶催化下進(jìn)行第二次羥基化作用，生成三羥基化合物；鄰醌具有強(qiáng)氧化能力，能將三羥基化合物氧化成羥基對醌或羥基鄰醌，此反應(yīng)無需酶參加；羥基醌容易聚合，這是主要的褐變反應(yīng)，且隨著聚合度的加大，顏色由紅變褐，最終產(chǎn)生褐色的黑色素。所以，酶促棕色化反應(yīng)的實質(zhì)在于煙葉中的酚類物質(zhì)（如綠原酸、咖啡酸、蕓香苷等）和自身為黃色的黃酮類物質(zhì)在煙葉變黃過程中轉(zhuǎn)化為多酚類物質(zhì)，它們經(jīng)過氧化產(chǎn)生淡紅色乃至黑褐色的醌類物質(zhì)，最終使煙葉顏色加深[10]。因此，煙葉的酶促褐變本質(zhì)上是多酚氧化酶間接作用的結(jié)果[11]。

2 煙葉調(diào)制階段酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生的條件及影響因素

2.1 外在因素

煙葉調(diào)制時誘導(dǎo)酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生的外部環(huán)境因素主要有兩個，一是調(diào)制溫度，二是環(huán)境相對濕度，兩者共同影響煙葉內(nèi)的水分含量和煙葉內(nèi)酶的活性，進(jìn)而影響棕色化反應(yīng)的發(fā)生[12]。一般來說，當(dāng)調(diào)制環(huán)境的相對濕度高于60%，溫度在45～46℃且煙葉失水量少于50%時，將導(dǎo)致酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生。但是，即使水分含量較高的新鮮煙葉，在此溫度范圍內(nèi)，只要環(huán)境相對濕度控制在60%以下，煙葉在變黃末期的失水量大于50%，則棕色化反應(yīng)就不易發(fā)生[11]。

2.2 內(nèi)在因素

2.2.1 變黃后期煙葉組織含水量 煙葉的生命活動狀態(tài)是保證酶促棕色化反應(yīng)進(jìn)行的必要條件[13]，而煙葉生命活動的強(qiáng)弱是由葉片水分狀況決定的[14]。因此，當(dāng)葉片處于變黃末期時，煙葉中的含水量直接決定了能否發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)[15]。若變黃階段失水量過少，則煙葉黃而僵硬，在后期調(diào)制階段隨著溫度的上升，極易發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)。若失水量適當(dāng)，則酶活性得到抑制，酶促棕色化反應(yīng)即可得到有效控制[16]。

2.2.2 煙葉組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性 隨著調(diào)制過程的不斷進(jìn)行，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞[17]。細(xì)胞內(nèi)的各種物質(zhì)與酶類混合在一起相互作用，促使酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生。細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞使氧分子能自由進(jìn)出細(xì)胞，氧化酶類活性增強(qiáng)，酶促棕色化反應(yīng)速度加快[18]。所以，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞的速度和程度直接影響了酶促棕色化反應(yīng)進(jìn)行的速度和進(jìn)程。

2.2.3 煙葉組織細(xì)胞多酚氧化酶（PPO） 活性多酚氧化酶（PPO）作為酶促棕色化反應(yīng)的介導(dǎo)物，其活性的大小直接影響該反應(yīng)的速度[11]。酶活性大小與細(xì)胞內(nèi)能自由進(jìn)出氧分子量的多少成正相關(guān)，也與溫度有直接關(guān)系。一般溫度低時，多酚氧化酶（PPO）活性較低，但隨著溫度升高，活性有上升趨勢。若在溫度升高的同時，配合相對濕度的降低，則多酚氧化酶活性會隨著調(diào)制時間的延長而逐漸降低[19]。

3 晾曬煙葉調(diào)制過程中酶促棕色化反應(yīng)的調(diào)控

3.1 多酚氧化酶（PPO）活性的調(diào)控

3.1.1 溫度與相對濕度 一般來說，溫度對多酚氧化酶（PPO）的活性影響主要在以下兩個方面：一方面當(dāng)溫度在45～50℃、相對濕度60%以上時隨著溫度的升高，酶活性降低；另一方面在溫度55℃、相對濕度60%以下時隨著溫度的升高，活性酶的比例下降[20]。因此，多酚氧化酶（PPO）最終的活性大小是由這兩方面綜合作用決定的。除溫度外，煙葉內(nèi)水分含量對多酚氧化酶（PPO）活性大小也是至關(guān)重要的。在變褐期調(diào)制房內(nèi)溫度為16～32℃，濕度控制為65%～75%條件下進(jìn)行調(diào)制可獲得較理想的效果[21]。雷東鋒等[22]通過對煙葉水分含量與多酚氧化酶（PPO）活性關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)，煙葉水勢條件為－872.78 kPa時，多酚氧化酶（PPO）活性最高。因此，要想進(jìn)行適宜的酶促棕色化反應(yīng)就應(yīng)該在煙葉調(diào)制過程中對其環(huán)境溫度和相對濕度進(jìn)行相應(yīng)的技術(shù)調(diào)控。

3.1.2 環(huán)境pH值 酸堿度是酶賴以生存的環(huán)境條件，每種酶只有在其適宜的pH值范圍內(nèi)才表現(xiàn)出應(yīng)有的活性。戴亞等[23]研究指出，引起酶促褐變的適宜pH值范圍在4～7之間，降低或提高介質(zhì)中的pH值，可以控制多酚氧化酶（PPO）活性。韓富根等[24]研究表明，在18～20℃條件下，煙葉中多酚氧化酶（PPO）在pH值為6.0時活性較強(qiáng)，在偏堿條件下，酶活性下降較快。在煙葉晾制過程中，若在調(diào)制房內(nèi)放置具有一定酸堿度的Ca、K、Mg鹽溶液即可調(diào)節(jié)pH值。

3.1.3 激活劑和抑制劑 CuCl2對多酚氧化酶（PPO）具有激活作用。銅離子有增強(qiáng)酶活性的功能，是煙草多酚氧化酶的良好激活劑。雷東鋒等[22]研究表明，當(dāng)銅離子濃度在 0.1～1.0 mmol·L－1濃度范圍內(nèi)，多酚氧化酶（PPO）活性凈增長百分率隨Cu2+濃度增加而增加，但增長幅度逐漸趨于平緩。李榮林等[25]對該酶性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究時發(fā)現(xiàn)，將該酶的最適溫度上升至40℃，最適pH值上移至7.0，酶對金屬離子的適應(yīng)性增強(qiáng)，對抑制劑敏感性下降。多個試驗表明，在相同濃度下CuSO4對多酚氧化酶抑制作用最強(qiáng)，其次是EDTA、對苯二酚、巰基乙醇和硫脲[26－28]。

3.2 環(huán)境氧氣濃度的調(diào)控

煙葉酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生的一個重要條件是氧氣的參與[29]，通過對調(diào)制房氧氣濃度的控制可有效調(diào)控該反應(yīng)進(jìn)行的速度。有研究指出，在煙葉調(diào)制過程中，當(dāng)環(huán)境氧氣體積分?jǐn)?shù)（濃度）高于5 000×106時，隨著氧氣濃度的增加煙葉褐變程度逐漸加重[30]。但當(dāng)環(huán)境氧氣體積分?jǐn)?shù)（濃度）在100×106時，酶促褐變基本上不會發(fā)生。因此，降低調(diào)制環(huán)境中氧氣的濃度可有效減少棕色化反應(yīng)的發(fā)生。另有研究發(fā)現(xiàn)，如果人為改變調(diào)制環(huán)境中氣相成分的組成比例（比如人工填充氮氣和二氧化碳），降低煙葉周圍氧氣濃度，則能抑制多酚氧化酶（PPO）的活性[31]。范堅強(qiáng)等[32]通過對密封煙垛進(jìn)行降氧處理，在一定程度上抑制了酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生。

4 展 望

目前，酶促棕色化反應(yīng)對煙葉感官質(zhì)量和外觀質(zhì)量的意義已被廣泛認(rèn)可[11]，而非酶促棕色化反應(yīng)理論則常應(yīng)用于白肋煙的高溫處理和煙絲加香加料中以改善煙葉品質(zhì)[33]。因此，如何合理地進(jìn)行調(diào)控是煙草科技工作者不懈努力和關(guān)注的問題?，F(xiàn)階段，調(diào)制過程中的調(diào)控方法一般都從控制氧氣濃度、調(diào)節(jié)多酚氧化酶（PPO）活性兩方面來進(jìn)行。雖已取得了較好的效果，但都還存在一定的局限性。僅從這兩方面入手，一方面資源投入量較大，經(jīng)濟(jì)成本較高，另一方面，需要消耗大量的人力勞動。因此，如何探索出更加簡單高效且經(jīng)濟(jì)的調(diào)控方法是所有煙草研究者共同努力的目標(biāo)。

有研究表明，植物自身存在某些可打破多酚氧化酶（PPO）潛伏狀態(tài)的激活劑，如菠菜中的亞麻酸、蠶豆中的游離脂肪酸等[34]。同樣，多酚氧化酶（PPO）的天然抑制劑也存在，如茶葉中的白花青素、橡黃素、菠菜葉中的草酸鹽等[35]。筆者認(rèn)為，煙葉自身也很有可能存在多酚氧化酶（PPO）激活劑和抑制劑，在調(diào)制過程中通過對環(huán)境的適當(dāng)調(diào)控使激活劑和抑制劑適當(dāng)表達(dá)，或者通過基因調(diào)控手段對多酚氧化酶（PPO）表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，將會對酶促棕色化反應(yīng)起到調(diào)控作用，有利于晾曬煙品質(zhì)的提升。因此，探索晾曬煙自身多酚氧化酶（PPO）表達(dá)以及采用天然激活劑和抑制劑的調(diào)控方法，是進(jìn)一步調(diào)控酶促棕色化反應(yīng)提高煙葉質(zhì)量的方法，并且也將是今后探索的方向。

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