術前外周血微小RNA-21、血管內皮生長因子、糖類抗原19-9水平與結直腸癌病人臨床分期和術后復發轉移的關系

吳永力 方漢剛 陳靜 閆瑞承

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是結直腸黏膜上皮起源的消化道惡性腫瘤，淋巴結轉移率高，術后易復發，預后較差[1]。CRC根據TNM分期采用相應方法進行治療，但仍有部分病人出現術后腫瘤復發轉移，對其生存期造成嚴重威脅[2-3]。尋求有效的CRC臨床分期診斷和術后復發轉移評估指標，有助于CRC治療方案的制定和臨床篩查術后復發轉移高危人群。有研究報道了血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、糖類抗原19-9(cancer antigen 19-9，CA19-9)在食管癌病人診斷及預后判斷中的作用，微小RNA-21(miR-21)、VEGF等是影響CRC病人預后的因素[4-5]。本研究探討外周血miR-21、VEGF、CA19-9水平與CRC臨床分期和術后復發轉移的關系。

對象與方法

一、對象

2019年10月～2020年10月本院行手術治療的CRC病人62例，為CRC組。納入標準：符合CRC診斷標準[6]，經臨床病理檢查證實；無放療、化療史，符合CRC手術指征[7]，行結腸癌根治手術；未使用糖皮質激素治療；病人及家屬了解并知情同意。排除標準：合并嚴重心、肝、腎等臟器功能不全及其它免疫性相關性疾病；合并免疫相關性疾病或凝血功能障礙。另選取62例同期于本院體檢并經檢查排除CRC的健康志愿者(healthy controls,HC)為HC組。CRC組年齡35～75歲，平均年齡(47.19±5.32)歲，男38例，女24例，其中TNM臨床分期I～II期35例，Ⅲ～Ⅳ期27例。HC組年齡33～75歲，平均年齡(47.62±5.45)歲，男41例，女21例。兩組年齡、性別等比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

二、方法

1.外周血miR-21相對表達量檢測：分別于術前1周和體檢當日清晨，采集所有入組被試空腹靜脈血3 ml，離心后取上清，采用Trizol試劑盒提取總RNA并檢測其純度和濃度，采用逆轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA，反應產物稀釋后作為實時熒光定量PCR(qRT-PCR)模板。使用實時熒光定量PCR儀進行引物擴增，每個樣品設3個復孔。以U6為內參，引物序列見表1。用2-△△CT方法計算miR-21的相對表達量。

表1 引物序列

2.血清CA19-9、VEGF水平檢測：分別于術前1周和體檢當日清晨，采集所有入組被試空腹靜脈血3 ml，離心后取上清，采用酶聯免疫法檢測VEGF水平，采用化學發光分析儀檢測CA19-9水平。CA19-9陽性診斷標準以CA19-9>27 U/L判定為陽性。

3.隨訪及術后復發轉移：62例CRC病人術后均通過門診進行隨訪，隨訪截至2021年10月31日，隨訪12個月，直至病人死亡或隨訪結束。根據術后隨訪期間病史、癥狀體征、實驗室、影像學和病理學檢查結果，記錄其術后腫瘤復發轉移發生情況。

4.觀察指標：比較CRC組和HC組外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平；比較TNM臨床分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期CRC病人外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平；比較術后復發轉移與無復發轉移的CRC病人外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平。

三、統計學處理

結果

1.兩組術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平比較見表2。結果表明，CRC組術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平高于HC組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 兩組術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平比較

2.不同TNM臨床分期CRC病人術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平比較見表3。結果表明，Ⅲ～Ⅳ期CRC病人術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平均高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 不同TNM臨床分期CRC病人術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平比較

3.CRC組病人術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平與TNM臨床分期的Spearman相關性分析:CRC組病人術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平與TNM臨床分期呈正相關(r=0.451、0.339和0.307，P<0.05)。

4.CRC組術后復發轉移與無復發轉移病人術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平比較見表4。CRC組術后復發轉移病人術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平高于無復發轉移病人，差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 CRC組復發轉移與無復發轉移病人術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平比較

5.術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平對CRC術后復發轉移的預測價值：術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平檢測評估CRC術后復發轉移的ROC曲線下面積(Area Under Curve，AUC)分別為0.779、0.722和0.702，術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9聯合檢測評估CRC術后復發轉移的AUC為0.843，具有最高的預測效能(P<0.05)。見圖1、表5。

圖1 術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9水平評估CRC術后復發轉移的ROC曲線

表5 術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9水平評估CRC術后復發轉移的ROC特征

討論

腫瘤分期可描述疾病的嚴重程度，早期發現和治療可延長生存期，提高生存質量[8]。CRC病人早期通常缺乏典型病理表現，且腫瘤分期越晚，其預后越差[9]。CA19-9是腫瘤分期診斷和術后復發轉移評估常用標志物， 具有促進腫瘤血管生成的作用，miR-21與腫瘤的發生、發展相關，在腫瘤的臨床診治中應用廣泛[10-11]。

本研究結果顯示，CRC組術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平高于HC組，說明CRC病人術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9呈現顯著升高趨勢。miR-21是一種具有調控功能的內源性小分子非編碼RNA，參與腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡過程，在腫瘤的發生發展中具有重要作用[12]。CA19-9是人體糖類抗原類血清腫瘤標志物，臨床中常應用于腫瘤臨床分期的輔助診斷[13]。腫瘤細胞在多種血管刺激生成因子誘導下，可合成釋放大量血管生成因子，促進腫瘤血管生成，VEGF是其中誘導效應較強的血管生成因子，可導致腫瘤血管異常生長[14]。本研究結果顯示，Ⅲ～Ⅳ期CRC病人術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期。采用Spearman相關性分析外周血miR-21、VEGF、CA19-9與CRC臨床分期的關系，結果顯示，術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9與臨床分期呈正相關，說明隨著腫瘤惡性程度的增高，CRC病人術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平明顯升高。miR-21表達與腫瘤細胞浸、潤侵襲能力有關，其高表達通常預示腫瘤浸潤深度增加，病情嚴重[12]。VEGF在腫瘤細胞團向實體腫瘤轉化過程中含量異常升高，對惡性腫瘤的早期篩查及臨床分期判斷具有重要的意義[14]。付蕾等[15]研究發現，CRC病人血清CA19-9水平與腫瘤分期及預后相關，說明術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9檢測對CRC病人TNM臨床分期具有較好的診斷價值。

本研究結果顯示，CRC組術后復發轉移病人術前外周血miR-21相對表達量和VEGF、CA19-9水平高于無復發轉移病人，說明術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9與CRC病人術后復發轉移有關。術后腫瘤復發轉移的CRC病人體內腫瘤細胞再次呈現異常增殖，并向其他組織、器官侵襲轉移，導致結直腸上皮組織及其他正常細胞破壞，刺激新生血管生成，使CA19-9等腫瘤標志物和VEGF水平升高。術后腫瘤細胞復發轉移常由多種miRNA調控，miR-21可通過調節血管形成等靶基因的表達使微環境改變，達到促進腫瘤復發轉移的作用。ROC分析術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9對CRC術后復發轉移的預測價值，結果顯示，術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9聯合檢測的AUC為0.834，說明術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9聯合檢測對CRC術后復發轉移評估具有較好評估價值。有研究發現，VEGF、CA19-9水平與結腸癌術后復發轉移發生相關,聯合檢測有助于評估腫瘤轉移情況，提示臨床可將術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9作為CRC術后復發轉移的動態監測指標。

綜上所述，CRC病人術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9水平明顯升高，且與其臨床分期呈正相關，術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9聯合檢測對CRC術后復發轉移具有較好的預測價值，可作為CRC病人臨床分期及術后復發轉移的可靠的監測指標。本研究的不足之處在于樣本數量有限，未對術前外周血miR-21、VEGF、CA19-9水平對CRC病人預后影響進行具體分析。