結核病的代謝組學研究進展

韋金濤 李華 邱恩明

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的一種慢性致死性傳染病，是目前全球單一病原體感染引起死亡的最主要原因，高于艾滋病[1]。作為一種胞內寄生菌，MTB依靠宿主細胞獲取其生命所需多種營養物質，并通過影響宿主細胞代謝從而引起宿主組織器官及各個系統水平的能量以及代謝紊亂[2]。因此，結核病患者體內往往存在蛋白質代謝、糖代謝等多種代謝紊亂。這為代謝組學研究廣泛應用于結核病研究奠定了基礎。

結核病疫情現狀

據估計截至2014年，全球MTB潛伏感染者已多達17億，占全球總人口的1/4[3]。受到HIV感染、營養不良、煙草等因素的影響，10%的MTB潛伏感染將在生命某一階段轉為活動性結核病[4]。WHO的報告顯示，2017年全球因結核病死亡例數多達130萬例(不包括30萬例HIV并發結核感染的死亡患者)，另外全球預計新發1000萬例結核病，新增55.8萬例利福平耐藥患者(其中82%為耐多藥結核病)[1]。耐藥結核病及HIV并發結核感染已成為終止結核病流行的重大障礙。

近年來，由于卡介苗接種、現有結核病診斷檢測手段的敏感度和特異度不足、新型檢測方法的成本高且臨床操作復雜等因素的影響，現有結核病診斷檢測手段已不能完全滿足當前結核病防治的需求。尋找高效、迅速、簡便且敏感度與特異度高的新型結核病診斷檢測方法是當務之急。同時，現有抗結核藥物存在多種不良反應，迫切需要研制新型抗結核藥物，其藥物不良反應產生的具體機制也有待進一步闡明；另外對患者經抗結核藥物治療后的效果評估也日趨重要。除此之外，尋找MTB毒力的影響因素、耐藥結核病的成因等依舊是當前面臨的重大難題。

代謝組學研究的優勢及現狀

代謝組學是一種對相對分子質量<1000的小分子代謝物進行表征的新興組學技術，主要用于研究基因、蛋白質和外界環境作用下機體代謝物的數量、種類及其變化規律。作為其他組學的最下游產物，代謝組學之前的基因、轉錄、蛋白質組學任一層面的改變都將影響特定代謝物的數量甚至存在狀態[5]。與受到表觀遺傳調節和翻譯后修飾的基因和蛋白質不同，代謝物可作為機體生化過程的直接標記，更加容易和表型相關聯[6]。因此，代謝組學與其他組學相比能更直接且全面地反映機體狀態。

目前，代謝組學研究模式主要分為靶向和非靶向兩種。常用技術主要包括核磁共振(MR)、質譜(MS)、氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)等。MR因為能提供大量物質結構信息而主要用于組織結構鑒定[7]，但其敏感度稍弱且對低豐度代謝物的檢測能力較差，對儀器要求也更高更昂貴[8]。MS則對樣本需求小、成本低，能對脂質、核苷類生物小分子，以及蛋白質、多肽等大分子進行測定及結構鑒定[7, 9]。近年來為了提高MS的敏感度、分辨率和選擇性，常將MS與多種技術聯用[8]。主要包括氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用(LC-MS) 及液相色譜-串聯質譜技術等。MS與其他技術聯用已成為代謝組學研究的常態。在數據統計分析方面，主成分分析法(PCA)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)是當前代謝組學研究最常用的分析方法，在尋找疾病診斷標記物中扮演著重要角色。目前，代謝組學已廣泛應用于卵巢癌、肺癌、糖尿病、肝癌、結核病等諸多臨床疾病的研究，在疾病診斷和治療方面的進展十分迅速，已成為一種不可或缺的臨床研究工具。

代謝組學在結核病研究中的進展

一、 MTB毒力的相關研究

MTB的毒力強弱與其致病性密切相關，其毒力相關因子很可能是未來抗結核藥物作用的潛在靶標。研究表明，MTB毒力主要與早期分泌蛋白、肽聚糖、分枝菌酸、代謝及轉錄因子等有關[10]。代謝作為MTB毒力的先決條件，在維持MTB毒力過程中不可或缺[11]。Puckett等[12]利用液相色譜-質譜(LC-MS)對惟一編碼蘋果酸合酶的glcB基因敲除菌株進行代謝監測，發現蘋果酸合酶的缺失會引起乙醛酸的積累及蘋果酸、天冬氨酸的減少，最終造成蘋果酸合酶缺陷菌株毒力衰減并出現生長抑制甚至死亡，雖然具體生理機制有待闡明，但蘋果酸合酶維持正常乙醛酸水平的功能已被證明對MTB毒力的維持至關重要。Ganapathy 等[13]基于代謝組學平臺發現果糖二磷酸酶(FBPase)的缺失能夠造成糖異生途徑的中斷，導致MTB毒力喪失從而被機體清除，但糖異生途徑中斷造成的磷酸化產物積累可能不是導致MTB被清除的原因。目前的研究表明，某些代謝途徑的中斷會導致MTB毒力減弱甚至死亡，但具體生理機制及其與代謝物積累之間的關系還需做進一步研究。

二、MTB與宿主營養機制的研究

從宿主細胞獲取營養是MTB存活的基礎。Zimmermann等[14]基于四級桿-飛行時間質譜(Q-TOF)對MTB感染的細胞進行非靶向代謝組學分析，發現宿主細胞能為MTB提供氨基酸、核苷酸、脂質、脂肪酸等多種營養物質；將其代謝組學和轉錄組學數據整合到無偏基因組規模代謝網絡模型，發現MTB在感染宿主巨噬細胞的早期需要消耗膽固醇、硬脂酸鹽、胞苷等33種不同的營養物質，這種宿主的多重營養供應將使MTB對外界干擾(如機體先天性免疫、抗生素等)具有一定的抵抗性，可望成為結核干預治療的代謝靶標。

宿主可通過“營養免疫”策略對在宿主細胞內消耗的營養物質進行調控來限制MTB生長[11]。Fe是MTB體內多種酶的氧化還原輔助因子，也是MTB在巨噬細胞中生長的必需元素[15]。Kurthkoti等[16]發現，結核肉芽腫中存在“Fe限制”環境，該環境中MTB對Fe的獲取受限從而阻礙MTB生長；超高液相色譜-質譜(UPLC-MS)聯合轉錄組學測序技術(RNAseq)研究發現，MTB通過對蛋白質中Fe的重吸收利用來抵抗這一不利環境。由此可見，宿主細胞既為MTB提供營養，又通過一系列策略消滅MTB，探索二者之間的關系對未來抗結核治療具有重要意義。

三、 MTB耐藥性的相關研究

MTB耐藥性是“消滅結核病”的一大障礙。編碼藥物作用靶分子的基因產生突變是目前MTB耐藥性形成的主要原因，但臨床上依然有5%～35%的MTB耐藥性形成不能用已知的基因突變解釋[17]。代謝組學已成為尋找未知MTB耐藥機制的有力工具。Nandakumar等[18]基于液相色譜-飛行時間質譜(LC-TOF-MS)技術對抗結核藥物作用的MTB內源代謝庫進行表征，發現MTB內部的異檸檬酸裂解酶(ICL)能夠抵抗抗生素誘導的氧化應激，從而介導廣泛的抗生素耐受性。對于生理濃度下NaCl介導的MTB表型耐藥性，Larrouy-Maumus等[19]運用LC-MS聯合13C標記技術發現，一定濃度的NaCl可導致MTB三羧酸循環和糖異生途徑的廣泛改變，但這并非生理濃度下NaCl介導MTB表型耐藥性產生的原因。HPLC-MS的脂質組學研究證實，質膜和外膜脂質重塑才是生理濃度下NaCl介導MTB表型耐藥性產生的原因。

表征MTB耐藥菌株的代謝特征能夠為未來耐藥結核病的治療尋找新的思路。rpoB、katG等基因的突變是導致MTB對INH、RFP等藥物產生耐藥性的主要原因[17]。Loots等[20-21]運用全二維氣相色譜-飛行時間質譜(GC×GC-TOF MS)檢測方法分別對rpoB和katG基因突變誘導的對RFP和INH耐藥的菌株進行代謝監測，發現對RFP耐藥的菌株中當烏頭酸全部耗竭會導致MTB 的mRNA不穩定，進而干擾MTB能量產生和代謝障礙，最終影響MTB生長；發現對INH耐藥的菌株中對羥基苯甲酸、尸胺等抗氧化應激物質增加，表明katG基因的缺失會導致INH耐藥菌株中氧化應激增強，MTB可利用抗壞血酸合成途徑等多種途徑來抵抗增強的氧化應激。耐藥基因突變會造成MTB內部較為特異的代謝改變，這些代謝改變很可能成為未來治療耐藥結核病的干擾靶標。

四、代謝組學在結核病診斷中的應用

早診斷是早治療的前提，也是控制結核病傳播的關鍵。目前，臨床結核病實驗室的診斷方法主要有痰涂片鏡檢、PPD皮膚試驗和結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)。痰涂片鏡檢最為特異且操作簡便，但陽性率極低。PPD試驗易受機體免疫和卡介苗接種的影響而出現假陽性結果[22-23]。臨床敏感度和特異度較高的結核病診斷手段是T-SPOT.TB。有研究顯示，其敏感度和特異度可分別達到79.7%和85.5%，但由于操作復雜、成本昂貴使其在基層的推廣和應用受限[24-25]。因此，亟待開發敏感、特異、且簡便快速的新型診斷方法。代謝組學是一種能對生物樣品中的代謝物進行無偏差多重分析和比較的新興技術，具有擴展診斷生物標記物庫的潛力[26]。利用代謝組學對機體代謝進行監測并篩選異于常態的代謝診斷標記物是未來結核病診斷的新方向。

尿液樣本因代謝信息豐富、無創獲取、且便于保存而被廣泛應用。Isa等[26]基于高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)技術確定了活動性肺結核患者尿液樣本中10種ROC曲線下面積值>85%的代謝物，最終發現N-乙酰基己糖胺、唾液酸3、新喋呤和二乙酰基精胺等4種物質聯合來區別活動性肺結核和非結核性肺病的敏感度和特異度都超過了82.0%。Luier和Loots[27]利用GCxGC-TOF MS鑒定了苯乙酸、色氨酸等17種泌尿系統結核的代謝標記物，表明結核病可引起患者機體脂肪酸和氨基酸特別是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的代謝異常，使患者具有與苯丙酮尿癥患者相似的代謝物譜。酪氨酸-苯丙氨酸途徑很可能是未來結核病診斷的潛在靶標。

血液是機體代謝物轉運的主要媒介。Feng等[28]利用超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)對結核病患者血清進行分析，鑒定了包括溶血磷脂酰膽堿、棕櫚酸等12種特征代謝標記物，研究表明溶血磷脂酰膽堿、山崳酸、蘇氨酰-γ-谷氨酸、前角鯊烯二磷酸等四者的組合是區分活動性結核病最適合的生物標志物組。對難以診斷的小兒結核病，Sun等[29]發現t-纈氨酸，丙酮酸和甜菜堿等3種標志物組合可用于兒童結核病診斷，其敏感度與特異度分別為82.4%和83.9%。

呼出氣體是呼吸系統結核病最直接的樣本來源。Kuntzel等[30]基于氣相色譜-質譜技術對接種分枝桿菌的培養基和對照組培養基上方的揮發性有機物(VOC)進行對比分析，鑒定了包括戊烷、庚烷等在內的17種VOC作為顯示分枝桿菌生長的潛在生物標志物。這表明通過對患者呼出氣體的標本進行代謝物分析有望成為未來診斷呼吸系統結核病的新手段。

結核病是引起胸腔積液的主要原因之一。Wang等[31]基于1H-NMR技術對20例結核性胸腔積液、20例惡性胸腔積液及18例滲出性胸腔積液標本進行分析，鑒定了包括L-乳酸、果糖、L-絲氨酸在內的26種特征代謝標記，其中乙酸、蛋氨酸、肌酸、檸檬酸、L-丙氨酸、LDL、L-乳酸、L-蘇氨酸等8種代謝物有助于區分上述3種胸腔積液。Che等[32]通過整合半靶向代謝組學平臺，并運用LC-MS/MS技術對156例患者胸腔積液標本(115例結核性胸腔積液、41例惡性胸腔積液)進行分析，發現結核性胸腔積液患者體內來自色氨酸代謝的犬尿氨酸途徑顯著增強，該研究表明色氨酸/犬尿氨酸比率在區分結核性胸腔積液和惡性胸腔積液方面的特異度和敏感度可分別達到86.1%、92.7%，當與腺苷脫氨酶(ADA)聯合診斷結核性胸腔積液時其敏感度和特異度可達到91.3%、97.6%。

結核性腦膜炎(TBM)診斷或治療的延遲都可能導致嚴重的神經系統后遺癥甚至死亡。Li等[33]基于1H MR技術對比了TBM和病毒性腦膜炎(VM)患者腦脊液的代謝特征，最終鑒定了甘氨酸、葡萄糖、L-谷氨酰胺等25種可用于TBM鑒別診斷的潛在生物標志物。Mason等[34]基于高敏感度氣相色譜-質譜(GC-MS)對比了兒童TBM患者和對照組腦脊液的氨基酸譜，發現TBM患者腦脊液內丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、賴氨酸和脯氨酸等5種氨基酸水平顯著上升，該研究表明TBM患者中腦脊液中存在大量未開發的生化信息，通過GC-MS進行氨基酸譜分析對TBM的早診斷、早治療有重要意義。

五、代謝組學在結核病治療中的應用

(一)抗結核藥物不良反應的代謝組學研究

抗結核藥物不良反應是抗結核治療失敗的重要原因，明確其不良反應的產生機制對未來指導結核病治療具有積極意義。代謝組學能夠監測藥物在機體的代謝狀況及藥物代謝引起的宿主代謝波動，在藥物不良反應研究方面具有很大的價值。Rawat等[35]首次將MR技術應用于吡嗪酰胺(PZA)對肝臟不良反應產生機制的研究，發現PZA的代謝產物吡嗪酸(PA)及5-羥基吡嗪酸(5-OHPA)通過介導氧化應激及炎癥反應來誘導大鼠肝不良反應的產生，且5-OHPA誘導肝產生不良反應的能力更強。有研究基于UPLC-MS方法發現抗結核藥物所致肝不良反應與磷酸戊糖途徑、嘌呤代謝和嘧啶代謝通路有關，其中嘌呤代謝中的黃嘌呤氧化酶能夠促進超氧化物的形成從而加重PZA及內源代謝物對產生肝不良反應的效應[36-37]。Ruan等[38]基于MR技術對INH產生急性不良反應的大鼠血清和腦脊液進行分析，發現INH能夠以劑量依賴方式誘導氧化應激、興奮/抑制性神經遞質紊亂、能量代謝紊亂及滲透壓平衡。Li等[39]利用超高效液相色譜(UPLC)-四極桿飛行時間質譜(QTOF MS)發現高劑量的INH能夠以劑量依賴性方式引起小鼠肝臟線粒體功能障礙，以及血紅蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)等物質積累，并能消耗肝臟中Vit B6從而阻斷Vit B6依賴的胱硫醚降解途徑。這些代謝改變都可能與INH誘導的肝不良反應有關。目前的研究表明，藥物代謝能夠影響機體內部眾多內生代謝途徑從而增加肝損傷風險，藥物代謝產物在這一過程中扮演著重要角色。

(二)代謝組學與新型抗結核藥物開發

不良反應及耐多藥結核病的產生需要研發新型抗結核藥物。但過去50年僅有德拉馬尼和貝達喹啉兩種新型抗結核藥物投入臨床(我國還未廣泛應用)，這遠遠不足以抵抗當前結核病的流行。

代謝組學能對體內藥物的定量代謝速率和相關代謝產物進行監測，為藥物優化提供依據，更好地指導抗菌素的設計和優化[40]。目前，代謝組學已具有監測異煙肼毒性的能力[41]。代謝組學還可用于諸多抗結核候選藥物未知機制的探索。例如Koen等[42-43]通過GC×GC-TOF MS方法證實了硫酸黏桿菌素和多黏菌素E主要通過破壞MTB細胞壁產生殺菌作用。Baptista等[44]發現pretomanid(一種新型抗結核藥)主要作用于磷酸戊糖途徑，最終導致有毒甲基乙二醛的積累。代謝組學還是尋找和評估新型藥物靶標的有力工具。例如Marshall等[45]基于NMR技術發現MTB細胞壁肽聚糖生成有關的D-丙氨酸途徑的關鍵酶丙氨酸消旋酶(Alr)不適合作為新型抗結核藥物的靶標，特定的Alr抑制劑也無殺菌效應。Prosser等[46]也提出，現有Alr抑制劑BCDA(β-氯-d-丙氨酸)真正的藥物靶標是谷氨酸消旋酶(Murl)而非D-丙氨酸途徑。除此之外，為了更早且更有效地開發新型藥物，Zampieri等[47]開發了一種能對未知生物活性化合物的作用模式(MOAS)進行快速分類的系統性代謝分析策略，該策略能對生物活性化合物處理后的分枝桿菌的特異性代謝響應進行分析，以鑒定該化合物的MOAS，最終加快藥物開發。

(三)代謝組學與抗結核藥物治療效果評估

抗結核藥物治療效果對患者預后及控制結核病傳播十分重要。代謝組學研究發現，在不同時間點接受抗結核藥物治療的患者尿液代謝譜呈現出明顯的治療依賴性趨勢，且痊愈的患者具有與健康患者相似的代謝特征[48]。結核病患者體內的某些特異性代謝物水平也會隨著抗結核藥物的治療而下降[26]，表明代謝組學在結核病治療效果評價方面具有巨大潛力。近來Luies等[49]基于GC×GC-TOF MS對21例治療成功和10例治療失敗的結核病患者尿液代謝譜進行分析，鑒定了2種與腸道菌群失衡相關的代謝因子3,5-二羥基苯甲酸和3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙酸，二者可在診療之前預測一線抗結核藥物治療能否成功。 Zetola等[50]將電子鼻(傳感器陣列)技術用于結核病診斷和治療效果監測，通過將51例肺結核(31例為HIV陽性)患者在不同治療時間點的呼吸標本與健康者呼吸標本進行檢測分析，發現該方法區別結核病患者和健康者的敏感度與特異度分別為94.1%和90.0%，因為呼吸信號的改變是不同時間點觀察到的，所以該實驗表明其可以用于對抗結核藥物治療效果的監測。

結 語

技術突破是實現“終止全球結核病流行”的關鍵。代謝組學是一種高通量、高敏感度的新興組學技術，能夠通過對機體內源性代謝進行定量監測來直觀地反映機體狀態。該技術目前已被廣泛應用于結核病的研究，并在某些方面開始與轉錄組學等技術進行聯合研究。未來多組學技術聯合研究是組學技術的發展方向。

目前，代謝組學在結核病領域的研究還存在諸多問題。例如，現行研究尚處于小樣本范疇，已鑒定的診斷標記物等研究成果能否應用于臨床尚需進行大樣本研究來加以驗證；代謝極易受到外界環境干擾，如何消除年齡、飲食等因素對代謝的影響是代謝組學面臨的困難；由于技術限制，目前還無法將研究標本中的代謝產物完全呈現并進行完整的代謝信息分析。盡管如此，隨著檢測和分析技術的不斷發展，代謝組學將極大地推動結核病防治領域的研究。