Lnc-H19對非甾體類抗炎藥腸病作用機制的研究

楊偉林 張爍

包括阿司匹林等在內的非甾體類抗炎藥（NSAIDs）是臨床上使用極為廣泛的藥物，對于治療冠心病及預防心腦血管不良事件具有十分重要的作用。然而伴隨藥物大量應用的同時，引起消化道損傷事件也日益受到重視。據美國ARAMIS統計，全美每年因NSAIDs導致胃腸道不良反應而住院的患者約為10.7萬人，僅在關節炎患者中因NSAIDs導致死亡有16500人，同艾滋病導致死亡人數幾乎相同，占全美死亡原因的第15位［1］。英國發表的一項研究表明，每年全英有2000人因NSAIDs所致消化道副反應而死亡［2］。我國目前尚無NSAIDs不良事件的具體資料，但因我國人口基數較大，且存在NSAIDs使用欠規范的情況，推測可能是世界上使用該類藥物最多的國家。

1 非甾體類抗炎藥腸病（NSAIDs腸病）

NSAIDs能夠引起腸道的特征性損傷，已在多個物種研究中得到了證實。而對于大鼠，這種損傷最為嚴重，在大鼠皮下注射吲哚美辛后，其腸道即會出現較為嚴重的炎癥表現并伴隨明顯出血及穿孔，常＜72h死亡［3］。人NSAIDs腸病一般表現為腸黏膜損傷、糜爛，而伴隨疾病發展，有出血甚至穿孔的風險，由此導致的住院率及病死率也較高。同時因NSAIDs引起的腸黏膜糜爛、出血，甚至狹窄及小腸隔膜而導致的死亡相較胃及十二指腸偏高［4］。前期研究通過膠囊內鏡發現健康志愿者口服NSAIDs二周后，71.4%的受檢者出現空腸或回腸黏膜損傷［5］。

然而目前NSAIDs腸病機制仍不十分明確。有學者認為NSAIDs抑制前列腺素（PG）合成是NSAIDs腸病發生的機制，長期使用NSAIDs致使PG合成不足削弱了黏膜的抵抗力導致小腸黏膜損傷［6］。然而，另有學者指出外源性PGs并不能阻斷NSAIDs誘導的小腸損傷［7］。亦有學者認為是NSAIDs溶解黏膜表面的磷脂，從而直接損傷上皮細胞的線粒體；而線粒體損傷減少細胞間的能量傳遞，導致鈣外流觸發細胞凋亡的發生，還可通過誘發自由基的產生導致細胞間連接斷裂［8］。此外，還包括心理壓力及糖皮質激素受體信號通路激活［9］、腸道微環境失調［10］等作用機制，而腸道微環境也是近來研究的熱點。但隨著研究的深入，發現腸黏膜機械屏障受損在NSAIDs腸病發病中具有重要作用，而腸黏膜屏障的完整對于腸道微環境及預防腸道細菌異位極為重要。因此明確腸黏膜損傷機制對于研究NSAIDs腸病尤為重要。

2 腸黏膜屏障

腸黏膜屏障實質是由腸上皮分泌的黏液、腸上皮細胞及其緊密連接等組成的防御性組織單層，在防止腸黏膜損傷方面起重要作用［11-12］。包括創傷、局部缺血、炎癥性腸病（IBD）、全胃腸外營養（TPN）及腸梗阻等在內的病理生理改變均能引起腸黏膜屏障急性或慢性損傷［13］。已有研究證實腸黏膜屏障損傷能夠增加腸道通透性，而這通常伴隨包括敗血癥、多器官功能衰竭在內的危重疾病，導致較高的發病率及病死率［14］。

在Blackler等［13］研究中發現腸黏膜屏障的損傷對于NSAIDs腸病發病具有重要作用。然而腸黏膜屏障損傷機制則不十分明確。通常在包括出血、創傷等病理生理改變情況下，腸上皮細胞內基因表達模式需作出快速調整以適應外部環境改變，雖然控制腸黏膜屏障完整性的基因表達程序在轉錄水平上會受到一定的影響，但由此誘發的能夠影響腸黏膜屏障的轉錄后事件已經得到越來越多的認識［15］。如前期研究［16-18］在證實腸黏膜屏障功能障礙是NSAIDs腸病發展和加重的基本病理基礎的同時，也發現NSAIDs可激活腸上皮細胞的PAR-2，后者通過激活ERK1/2途徑以下調細胞連接蛋白（ZO-1、claudin-1和occludin）及細胞骨架相關蛋白（角蛋白、微管蛋白），導致腸上皮的通透性增加，引發腸道損傷，進而導致NSAIDs腸病的發生。除此之外，mRNA的穩定性及翻譯模式的調節對于腸黏膜動態平衡也具有重要作用［19］，而其穩定性及轉錄則由包括Lnc-H19在內的LcnRNA等ncRNA調控［20］。因此明確Lnc-H19對于腸黏膜屏障損傷的機制，對于NSAIDs腸病發病機制研究十分必要。

3 長鏈非編碼RNA-H19（Lnc-H19）

LncRNA是長度＞200個核苷酸的，不具備蛋白編碼能力的轉錄RNA，最初被視為轉錄過程中的“暗物質”而不被重視。與表觀特征良好的RNAs不同，其與mRNA具有較多相似特征，比如均具有5'-甲基鳥苷酸帽和3'-聚腺嘌呤尾［21］。越來越多的研究證明LncRNA能夠通過調控基因表達水平而參與細胞及機體的病理生理過程。同時也有LncRNA具有調節染色質重塑，轉錄及轉錄后的調控及蛋白質代謝進程的功能。雖然在腸上皮中僅鑒定出較少的具有功能性及特異性的LncRNA，但其卻顯示出對于腸黏膜屏障的調節功能，對于維持腸上皮的完整性十分重要［22］。

Lnc-H19是一種2.3-kb的具有帽、剪接及多聚腺嘌呤尾結構的ncRNA，是Bartolomei等學者［23］于1991年發現的，其由定位于11p5.5染色體上的保守印記的H-19/igf2基因簇轉錄合成。H-19的表達在胚胎期顯著增加，出生后下降。其在細胞增殖、分化級浸潤等過程中均有重要作用［24］。多項研究證實，Lnc-H19能夠通過調控其下游miRNA的表達以實現對細胞過程的調節［25］。而最近研究發現，Lnc-H19過表達能夠影響下游miRNA的穩定性及轉錄過程，進而實現對腸黏膜屏障的調控。

4 Lnc-H19與腸黏膜屏障

Keniry等學者［25］發現Lnc-H19能夠通過調控其下游miRNA以實現對腸黏膜屏障的調節，而因其下游miRNA數量及功能的多樣，故Lnc-H19對于腸黏膜屏障的調控可能存在多種機制。

4.1 調控細胞連接（1）抑制TJ ZO-1、AJ E-鈣粘蛋白表達：包括緊密連接（TJ）及粘著連接（AJ）在內的細胞連接復合物，例如腸、腎臟及肺的細胞連接復合物，存在于胞間的分支狀封閉索網絡，是抵御多種有毒物質的重要屏障［26］。TJs和AJs間具有動態平衡，且組成胞間連接復合物的蛋白質也在胞外和胞內因子調控下進行重塑和流轉。兩者間的動態平衡對于維持腸上皮的功能至關重要，兩者或兩者間的動態平衡破壞，均能夠導致腸黏膜屏障的損傷。Zou等［27］研究發現Lnc-H19具有調控腸黏膜屏障的作用，且證明Lnc-H19能夠通過增加miR-675的表達水平以破壞具有表達TJ ZO-1及AJ E-鈣粘蛋白作用的mRNAs的穩定性及轉錄功能，進而實現對腸黏膜屏障的調控。

具有多種作用的RNA相關蛋白HUR對于調控腸黏膜屏障具有十分重要的作用。最近研究發現其與Lnc-H19具有相關性，而后續的研究則發現HUR能夠與Lnc-H19直接綁定，進而實現對腸黏膜屏障的調控［26，28］。而在Zou等的研究中則證明HUR能夠抑制miR-675引起的TJ ZO-1及AJ E-鈣粘蛋白相關的mRNAs表達的減少，且能夠緩解由Lnc-H19過表達引起腸黏膜屏障的損傷。因此作者認為Lnc-H19能夠通過抑制細胞連接相關蛋白的合成，進而造成腸黏膜屏障的損傷。而RNA相關蛋白HUR，對于研究改善由Lnc-H19引起的腸黏膜屏障損傷，提供新的思路。（2）促進AQP3表達：水通道蛋白（AQPs）是一種小型（30kDa/單體）疏水性整合膜蛋白，隸屬于MIP（主要內在蛋白）特殊超家族膜整合蛋白，大量研究表明，液體及電解質的轉運與AQPs密切相關［29］。AQP3主要存在于人類小腸及結腸的上皮細胞，對于維持腸道正常功能具有重要作用。而即使在反滲透梯度情況下，腸道黏膜仍能夠吸收或分泌大量水分，從而維持人體生理條件下的體液平衡。Zhang等研究發現敲除AQP3后的Caco-2細胞株出現因細胞緊密連接開放而導致的細胞通透性增高，而這可能與其影響細胞緊密連接蛋白的表達有關，但具體機制仍不明確［30］。同時Zhi等研究也發現在Caco-2細胞株中，miR-874能夠通過與AQP3 Mrna的3'UTR綁定進而抑制AQP3的表達［31］，而生物信息學研究則揭示Lnc-H19中存在與miR-874結合的7-聚體結合基序結合位點，并能夠與miR-874相互作用，同時證明在敲除Lnc-H19后的Caco-2細胞株中存在miR-874的上調及AQP3的下調，而Lnc-H19過表達的細胞株中則出現相反的結果。因此作者認為Lnc-H19能夠通過與miR-874相互作用以促進AQP3的表達，而過表達的AQP3則能夠降低腸黏膜細胞通透性，具有保護腸黏膜屏障的作用。然而這便與上述Zou等［27］的研究結果相悖，作者認為這可能是Lnc-H19靶點不同所導致的，因此對于Lnc-H19靶點的研究仍需進一步完善。

4.2 抑制維生素D受體（VDR）表達 VDR是介導人體內具有多種功能的1，25（OH）2D3的核受體，其對于多種組織類型的炎癥及腫瘤的形成具有重要作用［32］。研究發現VDR與包括潰瘍性結腸炎等在內的諸多疾病相關［33］。近年來大量研究證實1，25（OH）2D3對于腸黏膜屏障避免多種損傷介質對其造成的損傷具有重要作用［34］。Chen等［35］研究發現在潰瘍性結腸炎患者中VDR表達普遍降低，而Lnc-H19的表達則與其成負相關關系，而在Caco-2細胞株的實驗研究中，則發現過表達的Lnc-H19能夠通過上調miR-675-5p抑制VDR的表達，而這種效應能夠部分被miR-675-5p抑制劑所削弱。因此作者認為Lnc-H19尚能夠通過抑制VDR表達對腸黏膜屏障造成損傷，而實驗中提到miR-675-5p只能實現Lnc-H19部分的作用，因此同上述對于Lnc-H19靶點的研究仍需進一步完善。

5 小結

關于NSAIDs腸病發病機制的假設學說較多，但具體機制仍不清楚。消化疾病中關于Lnc-H19的研究雖然有一定數量，然而更多的只是初步研究，關乎NSAIDs腸病的研究資料則更少，甚至存在不同中心間結果矛盾的現象，這也提示Lnc-H19對于NSAIDs腸病等的調控機制是多樣的，即存在多靶點調控的現象。因此，關于Lnc-H19對NSAIDs腸病的作用機制仍需要大量且深入的實驗或臨床研究進一步闡明，而隨著研究的不斷深入，Lnc-H19可能將作為NSAIDs腸病診斷及治療的新希望。

［1］ Singh G. Recent considerations in non-steroidal anti-inflammatory drug gastropathy. Am J Med,1998,5:31S-38S.

［2］ Tramèr MR, Moore RA, Reynolds DJ, et al. Quantitative estimation of rare adverse events which follow a biological progression: a new model applied to chronic NSAID use. Pain,2000, 85: 169-182.

［3］ Whittle BJR, Salmon JA. Biosynthesis of prostacyclinand prostaglandin E2 in gastro-intestinal tissue. In:Turnburg LA, ed. 2:Intestinal secretion. Oxford:Oxprint, 1983: 69-73.

［4］ Ishihara M, Ohmiya N, Nakamura M, et al. Risk factors of symptomatic NSAID-induced small intestinal injury and diaphragm disease . Aliment Pharmacol Ther. 2014 Sep,40(5):538-47.

［5］ Huang C, Lu B, Fan YH, et al. Muscovite is protective against non-steroidal anti-inflammatory drug-induced small bowel injury. World J Gastroenterol. 2014 Aug 21,20(31):11012-8.

［6］ Fortun PJ, Hawkey CJ. Nonsteroidal antiinflammatory drugs and the small intestine. Curr Opin Gastroenterol. 2007,23:134-141

［7］ Playford RJ, Floyd DN, Macdonald CE, et al. Bovine colostrums is a health food supplement which prevents NSAID induced gut damage. Gut, 1999, 44(5): 653-658

［8］ Huang ES, Strate LL, Ho WW, et al. Long-term use of aspirin and the risk of gastrointestinal bleeding. Am J Med. 2011 May,124(5):426-33.

［9］ Yoshikawa K, Kurihara C, Furuhashi H, et al. Psychological stress exacerbates NSAID-induced small bowel injury by inducing changes in intestinal microbiota and permeability via glucocorticoid receptor signaling. Journal of gastroenterology, 2017, 52(1): 61-71.

［10］ Turner JR. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology, 2009, 9(11): 799-809.

［11］ Yang H, Rao JN, Wang JY. Posttranscriptional regulation of intestinal epithelial tight junction barrier by RNA-binding proteins and microRNAs. Tissue Barriers, 2014, 2(1): e28320.

［12］ Julio-Pieper M, Bravo JA, Aliaga E, et al. Review article:intestinal barrier dysfunction and central nervous system disorders-a controversial association. Alimentary pharmacology &therapeutics, 2014, 40(10): 1187-1201.

［13］ Besselink MG, van Santvoort HC, Renooij W, et al. Intestinal barrier dysfunction in a randomized trial of a specific probiotic composition in acute pancreatitis. Annals of surgery, 2009, 250(5):712-719.

［14］ Lee J, Mo JH, Katakura K, et al. Maintenance of colonic homeostasis by distinctive apical TLR9 signalling in intestinal epithelial cells. Nat Cell Biol 2006, 8:1327-1336.

［15］ 張爍,呂賓,姒健敏,等.非甾體抗炎藥對大鼠小腸黏膜機械屏障的影響. 中華內科雜志, 2009, 48(1): 44-47.

［16］ Chao G, Zhang S. Therapeutic effects of muscovite to nonsteroidal anti-inflammatory drugs-induced small intestinal disease. Int J Pharm, 2012, 436(1-2):154-160.

［17］ Zhang S, Chao GQ, Lu B. Proton pump inhibitors are not the key for therapying non-steroidal anti-inflammatory drugs-induced small intestinal injury. Rheumatol Int, 2013, 33(10):2513-21

［18］ Wang JY. Polyamines and mRNA stability in regulation of intestinal mucosal growth. Amino Acids, 2007, 33:241-252.

［19］ Wang JY, Xiao L, Wang JY. Posttranscriptional regulation of intestinal epithelial integrity by noncoding RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews Rna, 2016.

［20］ Wilusz JE, Sunwoo H, Spector DL. Long noncoding RNAs:functional surprises from the RNA world. Genes & Development,2009, 23(13):1494.

［21］ Mercer TR, Dinger ME, Mattick JS. Long non-coding RNAs:insights into functions. Nature Reviews Genetics, 2009, 10(3):155.

［22］ Ulitsky I, Bartel D P. lincRNAs: Genomics, Evolution, and Mechanisms. Cell, 2013, 154(1):26.

［23］ Bartolomei MS, Zemel S, Tilghman SM. Parental imprinting of the mouse H19 gene. Nature, 1991, 6322, 153-155.

［24］ Chao Y, Ran T, Xiang M, et al. Tag SNPs in long non-coding RNA H19 contribute to susceptibility to gastric cancer in the Chinese Han population, 2015, 6(17):15311-15320.

［25］ Wang J, Song YX, Wang ZN. Non-coding RNAs in gastric cancer. Gene, 2015, 560(1):1-8.

［26］ Dey BK, Pfeifer K, Dutta A. The H19 long noncoding RNA gives rise to microRNAs miR-675-3p and miR-675-5p to promote skeletal muscle differentiation and regeneration. Genes Dev, 2014, 28(5):491-501.

［27］ Zou T, Jaladanki S K, Liu L, et al. H19 Long Noncoding RNA Regulates Intestinal Epithelial Barrier Function via MicroRNA 675 by Interacting with RNA-Binding Protein HuR. Molecular& Cellular Biology, 2016, 36(9):1332.

［28］ Yang H, Rao JN, Wang JY. Posttranscriptional Regulation of Intestinal Epithelial Tight Junction Barrier by RNA-binding Proteins and microRNAs. Tissue Barriers, 2014, 2(1):e28320.

［29］ Cao C, Sun Y, Healey S, et al. EGFR-mediated expression of aquaporin-3 is involved in human skin fibroblast migration.Biochemical Journal, 2006, 400(2):225.

［30］ Zhang W, Xu Y, Chen Z, et al. Knockdown of aquaporin 3 is involved in intestinal barrier integrity impairment. Febs Letters,2011, 585(19):3113-3119.

［31］ Zhi X, Tao J, Li Z, et al. MiR-874 promotes intestinal barrier dysfunction through targeting AQP3 following intestinal ischemic injury. Febs Letters, 2014, 588(5):757-763.

［32］ Haussler MR, Whitfield GK, Haussler CA, et al. The nuclear vitamin D receptor: biological and molecular regulatory properties revealed. Journal of Bone & Mineral Research the Official Journal of the American Society for Bone & Mineral Research, 1998,13(3):325-349.

［33］ Weicheng Liu, Yunzi Chen, Maya Aharoni Golan, et al. Intestinal epithelial vitamin D receptor signaling inhibits experimental colitis. Journal of Clinical Investigation, 2013, 123(9):3983.

［34］ Chen SW, Wang PY, Zhu J, et al. Protective effect of 1,25-dihydroxyvitamin d3 on lipopolysaccharide-induced intestinal epithelialtight junction injury in caco-2 cell monolayers.Inflammation, 2015, 38:375-383.

［35］ Chen SW, Wang PY, Liu YC, et al. Effect of Long Noncoding RNA H19 Overexpression on Intestinal Barrier Function and Its Potential Role in the Pathogenesis of Ulcerative Colitis.Inflammatory Bowel Diseases, 2016, 22(11):2582.