千佛菌含藥血清對H22小鼠肝癌細胞增殖、凋亡的影響

胥 冰，張麗君，郭小蘭，石小玲

（陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046）

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑

藥材為陜西鎮安縣千佛菌種植基地千佛菌；四甲基偶氮唑藍（MTT，Sigma）；二甲基亞楓（DMSO，Sigma）；RPMI1640培養液（Hyclone）；胎牛血清。

1.2 主要儀器

5%CO2培養箱（BindCD-150），超凈工作臺（蘇州安泰），倒置熒光數碼顯微鏡NikonTS-100F（DS-5MC），精密電子天平（德國賽多利斯股份公司），流式細胞儀（BD，美國），二氧化碳恒溫細胞培養箱（BINDER C150）。

1.3 實驗動物、瘤株

SD大鼠20只，體質量（250±5）g，購自西安交通大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（陜）2007-001。小鼠H22肝癌細胞株，我校免疫室贈予。

2 實驗方法

2.1 含藥血清的制備及滅活

大鼠適應性喂養一周后隨機分為4組（n=4）：空白組；模型組；含藥血清大、小劑量組。含藥血清組，取500 g千佛菌加水大火煮沸轉文火煎煮120 min，此法煎煮2次，合并兩次濾液并濃縮至0.5 L相當于1 g/mL生藥量為原液，以原液為大劑量即100%濃度；生理鹽水倍比稀釋后為小劑量即50%濃度2.5 g/（kg·次）灌胃給藥，2次/d。空白組，給予同劑量生理鹽水[3]。連續7 d，末次灌胃2 h后，麻醉，采血，無菌分離血清，56℃，30 min滅活處理，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，置-20℃冰箱保存備用。

2.2 MTT法檢測千佛菌含藥血清對H22細胞增殖的影響

從液氮中取出H22細胞株復蘇。用含10% FBS 的1640培養基在37℃含5%CO2的孵箱中培養，至對數生長期，將其制備成密度為3×106/mL細胞懸液，接種于96孔培養板中，每孔100 μL。空白組加入1640培養液，含藥血清大劑量組加入100 μL100%含藥血清；含藥血清小劑量組：加入100 μL100%含藥血清，對照組：加入100 μL正常大鼠血清。每組設3個平行孔，培養24 h、48 h、72h后，每孔加入5 mg/mL的MTT10 μL，培養箱中繼續培養4 h后，棄掉上清，每孔加入150 ul DMSO，振蕩10 min，待結晶充分溶解，酶標儀490 nm處測定吸光度（A），計算抑制率。生長抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

2.3 流式細胞儀檢測H22細胞凋亡

據MTT實驗結果最終選定各組在48 h為最佳作用時間，將培養24 h的H22細胞，取兩瓶，分別加入大小劑量含藥血清，作用48 h，收集各組細胞，PBS洗滌2次，75%冰乙醇固定，避光加入碘化丙啶（PI）染液混勻30 min，流式細胞儀檢測，計數10000個細胞，檢測凋亡率，實驗重復3次，取均值。

2.5 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件對數據進行處理，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 千佛菌含藥血清對小鼠H22肝癌細胞增殖的影響

大、小劑量千佛菌含藥血清均對H22肝癌細胞的增殖有抑制作用 ，但大劑量更為明顯。抑制率呈明顯的時間-劑量依賴性，充分說明千佛菌能夠抑制腫瘤的增殖。

3.2 流式細胞儀檢測小鼠H22肝癌細胞凋亡

將不同劑量千佛菌含藥血清加入H22肝癌細胞培養48 h后，經流式細胞儀檢測，千佛菌含藥血清大、小劑量均能誘導H22肝癌細胞凋亡，而以大劑量組作用更顯著。與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。

4 討 論

千佛菌是一種藥、食兼用的珍稀食用真菌。主要含多糖、維生素、蛋白質以及微量元素等，其主要活性成分及抗腫瘤成分為灰樹花多糖，千佛菌具有“扶正固本”之功效。為祖國醫學之扶正固本藥，能增強機體的免疫力，改善癥狀，延長生存期，提高生活質量。本次實驗，我們通過制備千佛菌大鼠含藥血清，體外干預小鼠H22肝癌細胞24、48、72h發現均對H22肝癌細胞有一定的抑制增殖作用，且大劑量藥效最好。

綜上所述，本研究通過體外實驗，驗證了千佛菌含藥血清對小鼠H22肝癌細胞增殖、凋亡的影響，證實了千佛菌對H22細胞有較好的抑制作用，為臨床篩選抗腫瘤藥物，尤其為開發天然的低毒或無毒藥物提供了理論及實驗依據，也為腫瘤疾病的臨床治療提供了新思路、新方法。