常晨陽 常凱 朱秀煥 劉偉 韋偉

摘要 本文建立了由高效液相色譜-串聯質譜法定量準確、快速檢測大豆分離蛋白中三聚氰胺的方法。試樣中殘留的三聚氰胺經1%三氯乙酸溶液提取，經CX固相萃取柱凈化，用超高效液相色譜三重四極桿質譜聯用儀進行測定，通過外標法定量。三聚氰胺含量在10～100 ng/mL的范圍內與峰面積有良好的線性關系，相關系數為0.999 8，檢出限為5 ？滋g/kg。添加水平分別為0.02、0.05、0.10 mg/kg的樣品加標回收率為86.7%～101.6%，測定結果的相對標準偏差均小于5%（n=6）。該方法簡便、快速、準確、經濟，適用于大豆分離蛋白中三聚氰胺的測定。

關鍵詞 液相色譜-串聯質譜法；大豆分離蛋白；三聚氰胺

中圖分類號 O657.63 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）21-0252-02

大豆分離蛋白是以低溫脫溶大豆粕為原料生產的一種全價蛋白類食品添加劑[1]，外觀呈淡黃色、乳白色粉末狀，其蛋白質含量在90%以上，氨基酸種類有近20種，并含有人體必需氨基酸。因其營養豐富，不含膽固醇，是植物蛋白中為數不多的可替代動物蛋白的品種之一。又因其乳化性、水合性、吸油性、凝膠性、發泡性、結膜性等特性，廣泛應用在肉類制品、乳制品、面制品及蛋白粉等食品中。隨著近年來大豆分離蛋白營養價值的普及，國內外對大豆分離蛋白的需求旺盛，生產企業及生產數量規模化出現量化增長趨勢。

三聚氰胺（melamine，C3H6N6），是一種重要的氮雜環有機化工原料，食用三聚氰胺能誘發腎衰竭并導致死亡，是一種禁止用于食品及動物飼料中的化學物質。由于三聚氰胺中氮含量高達66%，較蛋白質氨基酸高 3～4倍，添加三聚氰胺可虛假提高蛋白質含量，降低成本，對人體健康構成威脅[2]。我國在“三鹿”事件發生后將三聚氰胺列入法檢目錄，要求不得在植物源蛋白類產品中檢出三聚氰胺。我國已經制定了多個三聚氰胺檢測國家及行業標準[4-6]，其中《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》（GB/T 22388—2008）和《飼料中三聚氰胺的測定》（NY/T 1372—2007）為乳制品檢測標準，《植物源產品中三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸的測定 氣相色譜-質譜法》（GB/T 22288—2008）雖為植物源產品檢測標準，但具體使用范圍僅限于小麥粉、玉米粉和大米粉，目前并沒有明確適用于大豆分離蛋白的檢測標準。筆者基于多年來檢測出口大豆分離蛋白產品的經驗，建立了采用高效液相色譜質譜法測定大豆分離蛋白中三聚氰胺的方法。該方法準確、快速、經濟，且無需經過衍生化處理，適用于大豆分離蛋白中三聚氰胺測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗儀器有高效液相色譜儀串聯三重四級桿質譜儀（日本島津有限公司LCMS-8040）、電子天平（瑞士梅特勒ME303）、高速離心機（日本日立 CF16RXⅡ）、漩渦混合器（德國IKA MS3 Digital）、氮空吹掃濃縮儀（中國斯帕特 SPT-24）、固相萃取裝置（中國楚定DG-24）。

試劑有：乙腈、甲醇，均為色譜純（美國默克公司）；三聚氰胺標準物質（純度>99.0%，農業部環境安全監控研究所）；其余化學試劑為分析純；試驗用水為超純水；CX固相萃取小柱（ACS Retain CX，60 mg/3 mL）。

1.2 標準溶液配制

準確稱取0.020 0 g三聚氰胺標準物質，用50%甲醇水溶解定容至100.0 mL容量瓶中，得到200 μg/mL標準儲備液；準確移取500 μL標準儲備液用流動相10 mmol/L乙酸銨/乙腈（體積比=4∶6）稀釋定容至100.0 mL，得到1.0 μg/mL標準中間液，再逐級稀釋成濃度為10、20、50、75、100 ng/mL的系列標準工作溶液供LC-MS/MS測定。

1.3 樣品處理

稱取試樣（2.5±0.01）g于50 mL離心管中，加入25 mL 1%三氯乙酸，渦旋混勻，在10 000 r/min條件下離心5 min，經中速定量濾紙過濾后收集濾液于新的50 mL離心管中待凈化。預活化固相萃取CX柱（分別用3 mL甲醇和3 mL水活化），加入10 mL上述濾液，后用3 mL水和3 mL甲醇分別洗滌CX柱子，減壓抽至近干后用3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，收集濾液。濾液經氮氣吹干后，加入1 mL流動相渦旋混勻，過0.2 μm PTFE濾膜，供LC-MS/MS測定。

1.4 色譜條件

色譜柱為C18柱（島津Shim-pack GISS 1.9 μm×2.1 mm×100 mm）。流動相為10 mmol/L乙酸銨-乙腈（體積比=4∶6）；流速為0.4 mL/min；進樣量為2 μL；柱溫為35 ℃。洗脫方式為等度洗脫。

1.5 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式，多反應監測MRM，干燥氣溫度為350 ℃，干燥氣流速為10 L/min，霧化器壓力為344.74 kPa；毛細管電壓為3 500 V。三聚氰胺的定性定量離子對、碎裂電壓、碰撞能量等參數見表1。

2 結果與分析

2.1 三聚氰胺溶液的配制

三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，微溶于水，可溶于甲醇，但配制標準溶液時稱取的粉末無法在純水或純甲醇中溶解，故選擇50%甲醇水作為配制儲備液的溶劑。之后工作使用液現用現配，使用同液質上機條件的流動相進行逐級稀釋。

2.2 前處理過程的優化

2.2.1 提取溶劑的選擇和優化。大豆分離蛋白屬于高蛋白基質，因而提取溶劑選擇了具有蛋白沉淀功能的三氯乙酸和乙酸鉛溶液。試驗對比了1% 三氯乙酸、3%三氯乙酸，發現高濃度三氯乙酸沉淀蛋白的效果更加明顯，但是隨著提取溶劑中三氯乙酸含量的增加，對色譜分析中色譜峰形產生較大影響或者有不出峰的現象。引入乙酸鉛溶液進行共沉淀，結果發現效果沒有顯著提升，且有引入重金屬的風險，最終選擇1%三氯乙酸溶液作為提取溶劑使用。

2.2.2 凈化條件的選擇。大豆分離蛋白基質呈粉狀，在三氯乙酸溶液中形成懸濁液，高速離心后仍有細小輕質懸浮粉末，濾紙過濾后肉眼不可見，這一步對于后續過柱凈化尤為重要。未經過濾的上清液會堵住小柱填料篩板，極大地影響過柱時間和回收效率。預活化后的陽離子交換柱CX，上樣后，三聚氰胺被吸附在填料上，依次用水和甲醇清洗樣品中水溶性雜質、無機鹽及非離子化脂溶性雜質。最終使用5%氨水甲醇堿性溶液三聚氰胺洗脫，洗脫效率可達98%以上。

2.3 色譜條件的優化

2.3.1 液相條件的優化。分離三聚氰胺目標物，對比使用了 HILIC、C8、C18色譜柱，由于三聚氰胺屬于強極性化合物，其在反相C8 色譜柱上保留效果較差，通過調整優化流動相的構成和比例，最終在常見的C18柱上得到有效保留并分離出峰，避免了親水性HILIC柱對進樣樣品高比例有機相的要求，節約了檢測成本。本試驗利用高效液相色譜儀進行樣品分離，故選取適合儀器的島津Shim-pack GISS 1.9 μm×2.1 mm×100 mm C18色譜柱，可以實現快速分離，在2 min之內就能完成單個樣品的檢測，大大縮短了檢測時間。在本試驗中的流動相，考察了0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇、10 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸水）溶液-甲醇和10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸水）-乙腈6種流動相組成體系。試驗結果發現，10 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈（體積比為40∶60）組成等度洗脫能夠得到更好的峰形和響應值，因而選擇了其作為流動相。三聚氰胺標準溶液的總離子流（TIC）色譜圖見圖1。

2.3.2 質譜條件的優化。分析發現三聚氰胺的結構，在高能碰撞后容易獲得加氫峰，負離子模式響應較差，故在檢測中，采用正離子模式檢測。首先選擇全掃描（SCAN）模式找到三聚氰胺的母離子m/z 127.2，然后選擇強度較高的加氫峰m/z 85.2、m/z 68.2作為子離子。通過調整干燥氣溫度、干燥氣流速、霧化器壓力、碎裂電壓和碰撞能量得到較高的靈敏度，確定最佳的質譜參數。

2.4 線性范圍和檢出限

在10～100 ng/mL質量濃度范圍內以峰面積Y為縱坐標，質量濃度X為橫坐標繪制標準工作曲線，得到線性方程為Y=289.588X+1 643.05，r=0.999 8。以信噪比S/N≥3時計算方法的檢出限為5 ？滋g/kg，方法靈敏度達到限量檢測要求。

2.5 精密度試驗

對20 μg/L標準溶液連續6次進樣，三聚氰胺保留時間和峰面積的相對標準偏差分別為0.09%和1.32%，儀器精密度良好。

2.6 方法的回收率和精密度

以大豆分離蛋白作為樣品，在陰性樣品中添加標準溶液的方法進行回收率和精密度測定，分別添加1 μg/mL標準中間液0.050、0.125、0.250 mL，得到添加水平分別為20、50、100 μg/kg的3組樣品，分別平行測6次，根據測定結果得到樣品中三聚氰胺的加標平均回收率在86.7%～101.6%之間，相對標準偏差小于5%，見表2。因此，本文所建立的方法具有可靠的準確度和精密度。

3 結論與討論

大豆分離蛋白中的三聚氰胺經1%三氯乙酸溶液提取，經CX固相萃取柱凈化，用超高效液相色譜三重四極桿質譜聯用儀測定，通過外標法定量。三聚氰胺含量在10～100 ng/mL的范圍內與峰面積有良好的線性關系，相關系數為0.999 8，檢出限為5 μg/kg。樣品加標回收率為86.7%～101.6%，測定結果的相對標準偏差均小于5%（n=6）。該方法簡便、快速、經濟、準確、高效，能夠滿足大豆分離蛋白中三聚氰胺的定性和定量檢測要求。

4 參考文獻

[1] 趙西周，梁少華.國內大豆分離蛋白生產現狀與發展建議[J].中國油脂，2012，37（8）：21-24.

[2] 董俏，李曦婷，王文超，等.三聚氰胺致病機理及毒性研究進展[J].家畜生態學報，2015，36（6）：1-4.

[3] 王志豪，楊水平.食品中三聚氰胺的檢測技術研究現狀[J].廣東化工，2016，43（10）：93-94.

[4] 植物源產品中三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸的測定 氣相色譜-質譜法：GB/T 22288-2008 [S].北京：中國標準出版社，2008.

[5] 原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法：GB/T 22388-2008[S].北京：中國標準出版社，2008.

[6] 飼料中三聚氰胺的測定：NY/T 1372-2007[S].北京：中國標準出版社，2007.