基于光干涉技術的葉片表面微結構特征獲取與表征

李青林， 王錦濤

(江蘇大學現代農業裝備與技術教育部重點實驗室，江蘇鎮江 212013)

葉片作為植物的營養器官，其細胞的結構變化一直被認為是作物生理狀態變化的重要指標[1-2]。近年來，研究人員開始關注植物葉片表面微結構與作物生理狀態之間關系的研究，并取得了很大進展。Franks等研究了不同養分條件下葉片表面結構的變化[3-7]；Kalicharan等研究了香茶菜表面絨毛的分布、形態及其隨時間的化學特征的變化[8]。

現有表面微結構的測量方法主要有掃描電鏡方法、原子力顯微鏡方法。掃描電鏡方法在植物葉片表面形貌觀察方面的應用最為廣泛，能得到分辨率高的表面形貌圖，但是需要對樣本進行復雜的前處理，用時較長，而且對結構參數的度量需要借助別的軟件才能完成；原子力顯微鏡方法是借助探針對被測量表面進行接觸測量，因為植物葉片表面是由細胞組成的，極易被損壞，所以該方法不適于葉片表面的測量。因此，研究人員進行了用于植物表面快速測量方法的探索。

Kim等借助白光干涉技術對松樹葉表面進行了觀察，并進行了葉片表面輪廓的定量表征[9]；Kim等利用白光干涉技術對紅楠樹葉表面的研究發現，葉片表面分布著顆粒狀、角狀突起物[10]；張艷借助白光干涉方法研究了透明膜表面三維輪廓變化情況，可以得到表面的三維輪廓，并同時測量出透明薄膜的三維形態信息和厚度[11]。

本研究旨在借助白光干涉方法，獲取植物葉片表面幾何特征，并根據其幾何形態特征選擇合適的參數對其進行表征。

1 測量原理

光干涉測量是一種利用光干涉原理測量光程差，從而測定被測對象表面微結構的方法[12]。如圖1所示，光源發出的光經分光鏡后分成2束，其中1束為參考光線，另1束經被測表面反射。根據2束光線的光程差，從而得到被測表面的結構，并可以進行測量表達。

2 微結構特征獲取方法

由于植物組織具有較柔軟的特殊性，不能保證和金屬樣本一樣緊貼在載物臺表面，因此本研究中采用載玻片的方法，將葉片樣本放在載玻片上之后，置于載物臺上(圖2)。從固定液中取出植物葉片樣本后，立刻置于25.4 mm×76.2 mm的載玻片上，葉片正面朝下，背面朝上，并使葉片緊貼載玻片，以保證葉肉樣本處于水平狀態。

調整物鏡和載物臺之間的距離(Z向，即垂直方向)使圖像聚焦，根據測量對象的不同，選擇合適的采集范圍。因為葉片表面絨毛高度遠遠大于氣孔、葉肉細胞以及維管束的高度，所以在觀察時，需要調整鏡頭Z向的距離。觀察氣孔、葉肉細胞以及維管束時，采集的高度最高為20 μm，用精細采集模式進行采集；需要觀察絨毛時，重新進行聚焦成像，此時設置采集的高度最高為200 μm，用精細采集模式進行采集。

在顯微系統下觀察葉片表面氣孔、葉肉細胞、維管束和絨毛的幾何特征，分別進行二維、三維成像，選取典型視野拍照。每個樣本至少觀察統計10個視野，取平均值。本研究中所有的測量數據均由測量系統自帶軟件測量并計算完成。

3 結果與分析

3.1 氣孔的形態參數

氣孔是由保衛細胞之間形成的凸透鏡狀的小孔，與其下細胞間隙(氣室)相連，在呼吸、蒸騰作用中，是空氣和水蒸氣的通路，具有重要的生理意義。葉片表面的氣孔數量和形態直接影響作物的生理狀態，因此需要表征氣孔的形態參數，從而確定它們對作物生理狀態的影響。圖3為葉片表面的氣孔分布情況。

為了滿足氣孔形態參數能表達作物生理狀態的要求，本研究選擇氣孔分布密度、氣孔的形態參數作為特征參數。用計數方法計量單位面積內氣孔的數量；用幾何測量方法來測量氣孔的大小；用高度測量、剖面測量和面積測量方法來綜合表征氣孔的形態特征，在葉肉大小為20 μm×20 μm的條件下，氣孔測量結果如下：氣孔直徑(15.23±3.35) μm，氣孔體積(33 889±249)μm3，氣孔表面積(3 778.033±80.748)μm2，氣孔密度(1 310.75±23.47)個/mm2。

3.2 葉肉表皮細胞的形態參數

葉肉表皮細胞是葉片表面分布最豐富的細胞，由圖4可以看出，葉肉表皮細胞結構也呈現出一定的凸凹狀，雖然生長狀態下表皮細胞呈充盈狀態，但當作物受到某種方式的脅迫時，表皮細胞形態會發生變化，所以需要評價葉肉表皮細胞的形態。植物表皮細胞一般按一定的方式緊密排列在一起，從而組成葉片表皮，且細胞形態相似，因此本研究對指定 20 μm×20 μm 區域葉肉表皮細胞的體積、表面積以及細胞數進行測量，相應的葉肉表皮細胞形態參數如下：體積(33 889±249)μm3，表面積(3 778.033±80.748)μm2，細胞數(53.1±2.7)個。

3.3 維管束的形態參數

葉片表面分布著豐富的維管束，維管束相互連接構成微管系統，輸導來自根部的水分、無機鹽和養分[13-14]，因此其密度、形態對作物的生理狀態有一定的指針作用。圖5是維管束分布示意，可見葉片表面維管束分布具有一定的規律性，但維管束直徑因其分布位置的不同而存在較大差異，為了充分表達維管束分布和幾何形態，本研究選擇幾何測量、剖面測量和體積測量的方法來表征維管束的形態參數，在葉面積200 μm×200 μm 的條件下，維管束各參數如下：直徑(36.23±4.65)μm，面積占葉面積40.3%，總體積(262 219±2 345)μm3。

3.4 絨毛的形態參數

葉片表面分布著絨毛，最新的研究表明，絨毛在作物的代謝方面有著重要的作用，從而影響作物的生理過程。為了實現用絨毛參數充分反映作物的生理狀態，本研究重點分析絨毛分布和絨毛形態。從圖6可以看出，絨毛高度遠遠大于周圍其他組織，因此用絨毛密度、高度和體積參數來表征其形態，在葉面積40 μm×40 μm的條件下，絨毛各參數如下：絨毛高度(195.245±10.245)μm，單根絨毛體積(202 772±574)μm3，絨毛密度(21.87±2.50)根/mm2。

4 討論

光干涉技術可以快速獲得葉片表面微結構形態，無須對樣本進行復雜的前處理。用該方法得到的圖片能反映葉片表面微結構，并且能在測量系統自帶軟件中實現微結構形態參數的測量。

根據葉片表面微結構并結合作物的生理代謝過程，本研究選擇了葉片表面氣孔分布和形態、維管束分布和直徑、葉肉表皮細胞形態、絨毛分布密度、絨毛高度和體積作為葉片表面微結構特征的表征參數，從而為基于葉片表面微結構進行作物生長信息模型的建立提供了依據。

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