棉油皂腳中棉酚的提取分析及鑒定

李文孝， 賈光鋒， 徐升運(yùn)， 陳衛(wèi)鋒， 張紅艷， 李忠玲

(1.陜西省科學(xué)院酶工程研究所，陜西西安 710600； 2.西安工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，陜西西安 710032；3.中科院西北生物農(nóng)業(yè)中心，陜西西安 710600)

棉酚(gossypol)別稱棉籽醇或棉花毒素，是一種廣泛存在于錦葵科棉屬植物棉花的種子、葉莖及根部等器官中的多酚類化合物。棉酚按其存在的形式可分為游離棉酚和結(jié)合棉酚，兩者之和稱為總棉酚[1]。一般認(rèn)為，結(jié)合棉酚不能被消化道吸收，游離棉酚能被消化道吸收，所以通常說的棉酚指的是游離棉酚。20世紀(jì)60年代，前蘇聯(lián)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)棉酚具有抑制動物腫瘤細(xì)胞的作用[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，棉酚除了具有抗腫瘤的生理功能，還具有抗生育[3]、抗瘧疾[4]、抗病毒[5]等多種生物學(xué)活性。由于棉酚的多個羥基極易被氧化變質(zhì)，因此研究獲得高純度、性質(zhì)相對穩(wěn)定的棉酚已成為醫(yī)藥工業(yè)的熱點問題。本研究嘗試在超聲波的輔助下，采用有機(jī)溶劑法從棉油加工廢棄物-皂腳中提取、制備出純度較高，性質(zhì)穩(wěn)定，具有高附加值醫(yī)藥用的醋酸棉酚。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 材料 棉油泥(陜西大荔偉恒生物科技有限公司)收集后冷凍保藏；醋酸棉酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.8%，美國Sigma公司)；人前列腺癌細(xì)胞系PC-3，由美國密西根大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.1.2 試驗儀器 KQ3200DE超聲波清洗機(jī)；DU640紫外-可見分光光度計；AL104電子分析天平；RE-5002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；PE2400元素分析儀；X-4數(shù)字顯微熔點測試儀；EQUINX55紅外光譜儀；AVANCF 300超導(dǎo)傅里葉數(shù)字核磁共振波譜儀；NUAIRE CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱；美國BIO-RAD550酶標(biāo)儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 棉酚的提取與測定

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用三氯甲烷配制成濃度分別為5、10、15、20、25 μg/mL的醋酸棉酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并以三氯甲烷為空白對照，在365 nm的紫外光下分別測定其吸光度。最后，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(C)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度(D)為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性回歸方程為

C=27.715 0D+0.682 6；

式中：P<0.000 1，r2=0.997 2。

1.2.1.2 樣品中醋酸棉酚含量的測定 用三氯甲烷溶解醋酸棉酚粗品，配制成濃度為15 μg/mL的溶液，在365 nm處以三氯甲烷為空白測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)回歸方程計算樣品中的棉酚質(zhì)量。以方程測算值與樣品質(zhì)量的比值作為樣品中的醋酸棉酚含量。

1.2.1.3 棉油皂腳中棉酚的提取 稱量100 g棉油皂腳攪拌分散于100 mL鹽酸酸化的甲醇中，置于超聲波清洗機(jī)中常溫輻射一段時間；再加熱、離心分離、減壓濃縮，向濃縮液中加入其1/3體積的冰醋酸；再在超聲波清洗機(jī)中處理一段時間；然后，于陰暗處靜置3 h或更久一些時間，待出現(xiàn)黃綠色沉淀；最后，經(jīng)減壓抽濾、石油醚洗滌、真空干燥得到醋酸棉酚粗品，稱其質(zhì)量即為制備的醋酸棉酚粗品質(zhì)量。再經(jīng)過酸化丙酮溶液重結(jié)晶可以制備出高純度醋酸棉酚。

1.2.2 醋酸棉酚的分析鑒定

1.2.2.1 熔點測試[6]調(diào)整好顯微熔點測試儀，用毛細(xì)管取微量醋酸棉酚的重結(jié)晶品置于載玻片上，用蓋玻片壓實，于電爐上控溫加熱，在顯微鏡下仔細(xì)觀察晶體變化，并記錄晶體開始熔化和完全熔化時的溫度。

1.2.2.2 元素分析[7]利用PE2400元素分析儀測定醋酸棉酚重結(jié)晶品的碳(C)、氫(H)、氧(O)3種元素含量。

1.2.2.3 紫外光譜掃描[8]將醋酸棉酚的重結(jié)晶品和標(biāo)準(zhǔn)品溶于新蒸餾的三氯甲烷中，配制成濃度為15 μg/mL的溶液。以三氯甲烷為空白對照，在200～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.2.4 紅外光譜分析[9]按照常規(guī)的溴化鉀壓片法測定醋酸棉酚重結(jié)晶品的紅外光譜圖。

1.2.2.5 核磁共振光譜分析[10]利用超導(dǎo)傅里葉數(shù)字核磁共振波譜儀測定醋酸棉酚重結(jié)晶品的核磁共振光譜圖。

1.2.4.6 抗腫瘤性能 根據(jù)Xu等的方法，用醋酸棉酚的重結(jié)晶品處理前列腺癌細(xì)胞系PC-3進(jìn)行抗腫瘤試驗[11]。最終數(shù)據(jù)采用Prims 5.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲萃取時間對醋酸棉酚產(chǎn)量和含量的影響

超聲波輔助萃取對提取物中醋酸棉酚的含量和產(chǎn)量隨著時間延長影響明顯。從圖1可見，從10～40 min棉酚的產(chǎn)量迅速增加達(dá)到最大值0.52 g，且提取物中醋酸棉酚含量逐漸提高至83.3%。可見，超聲波輔助下的最佳萃取時間為40 min。

2.2 酸濃度對醋酸棉酚產(chǎn)量和含量的影響

棉油堿煉時，棉酚和磷脂、多肽以及氨基酸等會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成性質(zhì)相對穩(wěn)定的Schiff’s化合物并隨皂腳一起沉降下來而被脫除。在酸性條件下，棉酚可以被重新釋放出來。由圖2可知，隨著酸濃度的提高，直到酸度達(dá)到1.4 mol/L時醋酸棉酚的產(chǎn)量和含量均迅速增加達(dá)到最大值0.54 g和 87.8%，繼續(xù)增加酸度棉酚產(chǎn)量和含量又出現(xiàn)緩慢下降。因此，1.4 mol/L是最佳的酸度控制點。

2.3 超聲結(jié)晶時間對棉酚產(chǎn)量和含量的影響

超聲結(jié)晶技術(shù)主要通過超聲波的空化效應(yīng)，使已形成的晶體、固體顆粒及時分散，獲得較小的晶體顆粒，推動晶體生長，縮短結(jié)晶時間，控制晶體粒徑的分布，提高設(shè)備的生產(chǎn)能力和產(chǎn)品質(zhì)量[12]。

由圖3可知，隨著超聲結(jié)晶時間延長，制備的醋酸棉酚產(chǎn)品質(zhì)量、含量不斷增加。30 min時產(chǎn)品含量達(dá)最高值89.6%時，獲得0.63 g醋酸棉酚粗品，隨后隨時間延長，產(chǎn)品質(zhì)量雖有小幅增加但含量卻下降明顯。通過試驗發(fā)現(xiàn)，超過30 min后產(chǎn)品中雜質(zhì)含量增大對重結(jié)晶制備高純度產(chǎn)品會形成較大影響，所以選擇合適的超聲誘導(dǎo)結(jié)晶時間為20～30 min。

2.4 醋酸棉酚的結(jié)構(gòu)與性能

2.4.1 熔點測試 通過本工藝生產(chǎn)的醋酸棉酚重結(jié)晶品經(jīng)顯微熔點測定儀測定，其熔點為178～180 ℃，熔程窄、純度高，符合2015版《中國藥典》規(guī)定的藥用醋酸棉酚熔點為 175～180 ℃ 的要求，可以滿足藥物原料技術(shù)要求。

2.4.2 化學(xué)元素分析 將制取的重結(jié)晶醋酸棉酚樣品置于PE2400元素分析儀中進(jìn)行測定，得到樣品中C、H、O等3種元素的含量(表1)。醋酸棉酚樣品中3種元素的測量值幾乎均與理論值一致，因此可以判斷提取的醋酸棉酚符合醋酸棉酚的分子式。

表1 醋酸棉酚C32H34O10元素分析結(jié)果

2.4.3 紫外光譜鑒定 使用紫外-可見吸收光譜法對有機(jī)化合物進(jìn)行鑒別，主要依據(jù)有機(jī)化合物吸收光譜的形狀，吸收峰的數(shù)目，各吸收峰的波長位置、強(qiáng)度及相應(yīng)的吸光度等。從圖4可知，醋酸棉酚樣品與標(biāo)準(zhǔn)品均在243、278、289、365 nm波長處有最大吸收度。另外，從紫外掃描圖譜中可以發(fā)現(xiàn)，365 nm處波形呈正態(tài)分布，與醋酸棉酚定量測定試驗中選擇365 nm作為最大吸收波一致，說明樣品與醋酸棉酚標(biāo)準(zhǔn)品可能為同一物質(zhì)。

2.4.51H NMER結(jié)構(gòu)分析 用三氯甲烷作溶劑，以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，獲得醋酸棉酚的核磁共振氫譜(圖6)。化學(xué)位移依次為標(biāo)準(zhǔn)品，1.56(d，12，J=6.56 Hz，12—CH3，12′—CH3，13—CH3，13′—CH3)，2.13(s，6，14—CH3，14′—CH3，2.34(s，3，13—CH3)，3.58(m，2，11—CH)，5.79(s，2，1—C—OH，1′—C—OH)，6.44(s，2，6—C—OH，6′—C—OH)，7.73(s，2，4—C—H，4′—C—H)，8.45(s，1，17—COOH)，11.15(s，2，15—CHO，15′—CHO)，15.21(s，2，7—C—OH，7′—C—OH)；樣品，1.56(d，12，J=6.56 Hz，12—CH3，12′—CH3，13—CH3，13′—CH3)，2.13(s，6，14—CH3，14′—CH3)，2.34(s，3，13—CH3)，3.57(m，2，11—CH)，5.73(s，2，1—C—OH1′—C—OH)，6.44(s，2，6—C—OH，6′—C—OH)，7.76(s，2，4—C—H，4′—C—H)，8.46(s，1，17—COOH)，11.15(s，2，15—CHO，15′—CHO)，15.22(s，2，7—C—OH，7′—C—OH)。醋酸棉酚標(biāo)準(zhǔn)品和醋酸棉酚重結(jié)晶品產(chǎn)生相同的磁響應(yīng)信號，可以證明重結(jié)晶品具有標(biāo)準(zhǔn)品相近的純度，同時也證明了兩者為同一種物質(zhì)。

2.4.6 抗腫瘤性能 為檢驗超聲波輔助溶劑法提取醋酸棉酚的生物活性，用重結(jié)晶醋酸棉酚品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行體外前列腺癌細(xì)胞PC-3培養(yǎng)試驗。在抑制腫瘤細(xì)胞時，醋酸棉酚重結(jié)晶品的半數(shù)抑制濃度(IC50)值略小于標(biāo)準(zhǔn)品，可以達(dá)到 8.01 μmol/L，說明該工藝提取的醋酸棉酚具有抗腫瘤生物活性。

3 結(jié)論與討論

利用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取法從棉油加工廢棄物——皂腳中提取、制備出純度較高、性質(zhì)穩(wěn)定，具有藥用價值的醋酸棉酚，一方面可以實現(xiàn)變廢為寶，另一方面可有效提高棉籽加工業(yè)的附加值。利用熔點測定、元素分析、紫外掃描、紅外光譜分析、核磁共振光譜分析及抗腫瘤試驗，證明本工藝制備的醋酸棉酚重結(jié)晶品與標(biāo)準(zhǔn)品是同一物質(zhì)，說明超聲波輔助下的有機(jī)溶劑提取醋酸棉酚工藝是可行的。

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