黑蒜加工過程中多酚含量變化及抗氧化活性

強 倩， 羅海青， 張建梅， 沈 婷， 王新風， 胡衛成， 紀麗蓮，3

(1.淮陰師范學院/江蘇省高校區域現代農業與環境保護協同創新中心，江蘇淮安 223300； 2.淮陰師范學院生命科學學院/

大蒜是一種古老的藥食兩用植物，在我國已有2 000多年的種植歷史[1]，是我國的特色農產品和傳統調味料，其性味溫熱，具有抗菌、抗氧化、降血糖、護肝及殺蟲等性能[2]。此外，大蒜作為一種具有多種生物學效應的傳統藥物，能緩解疲勞，增加體力，幫助消化，預防腹瀉及蠕蟲感染，可用于治療心臟病和關節炎[3]。相關研究表明，大蒜具有抗腫瘤功能，可誘導人體產生強烈的TH1免疫反應[4]。我國大蒜消費主要以其原料和初級加工產品為主，其中腌漬蒜產品在大蒜的加工和貿易中占主要地位[5]。目前，幾種大蒜產品如脫水大蒜粉、大蒜精油、大蒜油浸膏和老化的大蒜提取物已被逐漸引入市場[6]。

黑蒜，又名黑大蒜，是以新鮮大蒜為原料，在嚴格控制溫度和濕度的情況下發酵而成的一種新型大蒜制品。黑蒜在加工過程中，自身的組織被破壞，其物質所發生的一系列的酶促反應和非酶褐變反應，其中包括美拉德反應、焦糖化反應等[7]。黑蒜在加工過程中變成黑色，同時，呈色物質本身也有一些生物活性。加工后的黑蒜無辛辣及刺激性氣味，具有高含量的多糖、還原糖、蛋白質、酚類化合物、有機硫化合物和類黑素[8]，其中多酚類物質含量高出5倍以上[9]，其超氧化物歧化酶活性高出10倍以上[10]，這使得生大蒜的抗氧化功效有了很大的提高，對保持人體健康起著積極作用。目前對黑蒜的相關文獻報道很少，對黑蒜抗氧化機制的研究尚未清楚，為了對黑蒜的進一步開發利用提供科學依據，本試驗對黑蒜的抗氧化性進行研究，并以DPPH清除率、Fe3+還原能力、ABTS清除率及氧自由基清除能力測定黑蒜的抗氧化能力，以期明確黑蒜的抗氧化能力，為黑蒜深加工利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白蒜及黑蒜由菏澤天鴻果蔬有限公司提供；2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、水溶性維生素E(Trolox)、熒光素(FL)、2，2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP)槲皮素(Quercetin)、沒食子酸、福林試劑、碳酸鈉、鐵氰化鉀、硫酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鐵、甲醇、無水乙醇均為分析純。

DHG-9240A型烘箱，上海精宏實驗設備有限公司；Centrifuge 5418型離心機，德國Eppendorf公司；分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；ecan infinite M200PRO酶標儀，瑞士Tecan公司；Q-250B3高速多功能粉碎機，上海冰都電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品提取液的制備 將新鮮的白蒜、黑蒜烘干至恒質量，加入粉碎機粉碎后，分別稱取1 g白蒜、黑蒜樣品機械粉，按1 ∶20的料液比加入50%的乙醇溶液20 mL，于30 ℃超聲提取30 min，離心、過濾，用50%的乙醇定容至20 mL作為樣品液待用。

1.2.2 黑蒜加工前后多酚含量的測定[11]

1.2.2.1 多酚標準曲線的繪制 準確稱取0.02 g沒食子酸標準品置于燒杯中，用80%乙醇溶解后定容至50 mL，得到400 mg/mL沒食子酸標準溶液。用移液槍吸取沒食子酸的標準溶液0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、350.0、400.0 μL，分別置于12支離心管中，向每支離心管中各加入80%乙醇至0.2 mL。依次加入1 mL蒸餾水，0.2 mL 福林試劑，混勻靜置3 min后，加入0.6 mL 7.5%碳酸鈉，再次混勻，靜置40 min后，在D765 nm處測定其吸光度。并以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線，y=0.007 1x+0.016 9，r2=0.999 8。式中y為吸光度；x為多酚質量濃度(mg/mL)。

1.2.2.2 樣品測定 取制備好的白蒜、黑蒜乙醇提取液 1 mL，按照標準曲線的測定方法，在D765 nm處測定其吸光度。根據回歸方程計算黑蒜加工過程中多酚含量，樣品總多酚含量以每克樣品中所含沒食子酸的毫克數表示(mg GA eq/g)。

1.2.3 黑蒜加工前后體外抗氧化能力的測定

1.2.3.1 清除DPPH自由基的測定 按濃度大小依次向96孔透明板中加入100 μL白蒜、黑蒜提取液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg/mL)，再分別加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液。依照相同的操作方法，將不同濃度的樣品液分別與甲醇混勻作為空白組，DPPH溶液與甲醇混勻作為對照組。室溫避光靜置30 min后，在D517 nm處測其吸光值，重復3次，每次3組平行，取平均值。

式中：D1為DPPH溶液與樣品液的吸光度之和；D2為樣品液與提取溶劑的吸光度之和；D3為DPPH溶液與提取溶劑的吸光度之和。

1.2.3.2 Fe3+還原能力的測定[12-13]準確吸取0.2 mL不同濃度白蒜、黑蒜提取液(0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/mL)置于5支2 mL離心管中，分別加入0.5 mL 0.2 mol/L pH值6.6磷酸緩沖液和0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后，于50 ℃溫度下水浴20 min，然后加入0.5 mL 10%的三氯化鐵溶液(TCA)，混合均勻，置于離心機中以 5 000 r/min 離心5 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL蒸餾水和0.1 mL 0.1%氯化鐵溶液，混勻后，靜置10 min，在D700 nm處測其吸光值，重復3次，每次3組平行，取平均值。

1.2.3.3 清除ABTS+自由基的測定 用PBS(pH值=7.4)配制7 mmol/L的ABTS+溶液，將7 mmol/L的ABTS和 2.45 mmol/L 過硫酸鉀等體積混合均勻，在室溫下避光反應12～16 h生成ABTS+儲備液，使用前用PBS稀釋到D734 nm處吸光度為0.66±0.03的工作液。取20 μL不同濃度白蒜、黑蒜提取液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg/mL)加到96孔透明酶標板中，分別加入150 μL 0.2 mmol/L ABTS+儲備液，以PBS作為對照，室溫下反應 10 min 后，在D517 nm處測其吸光值，重復3次，每次3組平行，取平均值。

式中：D0為ABTS+工作液與PBS的吸光度之和；D為ABTS+工作液與樣品液的吸光度之和。

1.2.3.4 氧自由基吸收能力(ORAC)的測定 取不同濃度白蒜、黑蒜提取液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg/mL)和Trolox標準液(用pH值=7.4的75 mmol/L PBS稀釋)20 μL加到96孔黑色酶標板中，分別加入180 μL FL，在37 ℃條件下孵育20 min，隨后加入20 μL 119 mmol/L的ABAP溶液。用485 nm激發波長和535 nm發射波長測定其熒光強度，測定時間間隔為5 min，連續測定35次。ORAC值以Trolox當量表達，單位為mmol TE/g DW。

2 結果與分析

2.1 黑蒜加工前后多酚含量比較

多酚類物質含有多個酚基團，具有良好的抗氧化性和抗癌活性。多酚類物質種類很多、結構各異，其抗氧化性、生物利用率及對人體影響也有所不同，在食品醫藥中具有廣泛的應用。多酚類物質的提取率不僅因溶劑種類、提取時間、提取溫度、溶劑用量等條件的不同而存在差異，同時，在天然產物中多酚類物質因種類的不同，其含量也存在很大差異[14]。本試驗利用50%的乙醇分別對白蒜、黑蒜粉末進行提取，采用福林-酚法測定其多酚的含量，從圖1可以看出，白蒜、黑蒜的多酚含量分別為0.49、2.60 mg GA eq/g，二者差異顯著。表明黑蒜在發酵過程中，多酚含量增加，本結果與連毅等的研究結果[9]一致。安東認為，多酚類物質含量的增加可能是因為大化合物釋放出更多的酚羥基，使多酚的相對含量升高[15]；Kwon等指出，可能是在高溫情況下其他化合物轉化成了多酚類物質[16]。表明黑蒜在發酵過程中多酚類物質增加，使黑蒜具有更好的抗氧化、抗癌活性。

2.2 黑蒜加工前后體外抗氧化活性

酚類物質組成比較復雜，其種類和含量隨著植物品種、成熟度、季節域等不同有很大差異，單一的抗氧化方法很難完全有效地對其含量及活性進行測定，而且不同的方法研究結果也存在很大差異，且缺乏可比性。因此，選用多種方法對其進行研究，力求全面對其抗氧化活性進行評價。

2.2.1 黑蒜加工前后對DPPH自由基的清除作用 DPPH是一種具有單電子、穩定的氮中心的自由基，廣泛用于動植物提取物或者食品的抗氧化特性評價。當自由基清除劑存在時，DPPH自由基接受一個電子或氫原子，形成穩定的化合物，使其溶液從深紫色變為淡黃色，變色程度與其接受的電子數量成定量關系，可通過吸光值大小來判斷清除能力。本研究用酶標儀對其吸光值進行測定。從圖2可以看出，黑蒜在加工前后對DPPH自由基都有清除能力，且隨著樣品濃度的增加，DPPH的清除能力增強，黑蒜加工前后半抑制濃度IC50(指對DPPH自由基清除率達到50%時所需樣品的濃度)分別為13.98、5.99 mg/mL，與王衛東等所報道的黑蒜的自由基的清除率是普通大蒜的3倍結論[17]一致。這可能是由于黑蒜加工過程中多酚含量增加，抗氧化能力增強，對自由基的清除能力也增強。

2.2.2 黑蒜加工前后的還原力 還原力是用來評價抗氧化劑活性的常用方法，根據樣品本身的還原作用，給出電子清除

自由基，樣品作為一種還原劑，其還原能力越強，抗氧化能力越強，反之越弱。相關文獻報道，樣品中的多酚類化合物可作為一種很強的天然抗氧化劑，具有很強的抗氧化性，可以通過測定其還原力來評價其抗氧化能力。從圖3可以看出，不同質量濃度下白蒜與黑蒜提取液還原能力的強弱，相同濃度下黑蒜的還原力明顯高于白蒜，在低濃度情況下白蒜和黑蒜的還原能力不明顯，當濃度達到2.5 mg/mL時，黑蒜的還原力為白蒜的1.82倍，且隨著提取液濃度的升高，還原能力也逐漸升高。相關文獻報道樣品的還原能力強弱與樣品中所含的多酚類物質呈正相關性[18]，本試驗中，白蒜總酚的含量 0.49 mg GA eq/g，而黑蒜的總酚含量達到 2.60 mg GA eq/g，是白蒜的5倍之多，從而證實了黑蒜的還原能力強于白蒜。

2.2.3 黑蒜加工前后對ABTS+自由基的清除 從圖4可以看出，黑蒜加工前后ABTS+清除能力與濃度呈正相關性，即隨著樣品濃度的增加，清除率逐漸升高，黑蒜ABTS+清除率明顯高于白蒜，且隨著樣品濃度的增大清除能力差別明顯。在濃度為0.05 mg/mL時，白蒜、黑蒜提取液對ABTS+沒有清除作用，隨著濃度的增大，當濃度為0.50 mg/mL時，白蒜的清除率為6.23%，黑蒜的清除率為20.35%；當濃度為 1 mg/mL 時，白蒜的清除率為11.23%，黑蒜的清除率為38.71%，即隨著濃度的增加，白蒜、黑蒜的清除率都在上升，且黑蒜的清除能力強于白蒜。這可能是由于濃度的增大，白蒜、黑蒜中活性成分含量升高。總體來看，黑蒜提取液的ABTS+自由基的清除能力明顯優于白蒜，一方面可能與多酚含量有關，黑蒜在加工過程中多酚含量是白蒜的5倍以上；另一方面可能與多酚的形態有關，黑蒜在加工過程中可能產生很多游離多酚類物質且其具有很強的ABTS+自由基清除能力。因此，黑蒜對ABTS+的清除率明顯高于白蒜。

2.2.4 黑蒜加工前后對氧自由基的清除能力 ORAC抗氧化原理是指自由基能破壞熒光探針，使熒光強度發生變化，其變化的大小反映自由基破壞的程度。抗氧化劑可以抑制由自由基引起的熒光變化，而抑制程度能反映其對自由基的抗氧化能力的大小。從圖5可以看出，無論是白蒜、黑蒜均顯示出對氧自由基清除能力，但是黑蒜的清除能力比白蒜的要強，白蒜的氧自由基吸收能力為324.43 μmol TE/g DM，黑蒜吸收能力達到了984.56 μmol TE/g DM，二者差異顯著。這與DPPH、Fe3+還原能力的結果一致，這是由于黑蒜中的多酚含量明顯高于白蒜。

3 結論

與普通的白蒜相比，黑蒜以其極高的營養價值和保健價值受到很多消費者歡迎。黑蒜加工前后的多酚含量存在顯著差異，經發酵后的黑蒜多酚含量增加了4倍以上，使黑蒜具有更好的抗氧化、抗癌活性。黑蒜加工過程中多酚含量增加，抗氧化能力增強，使得加工后的黑蒜對DPPH自由基清除能力增加了1倍多。黑蒜加工前后的還原能力與其多酚含量呈正相關，相同濃度下，經發酵后的黑蒜的還原力明顯高于白蒜；ABTS+清除能力與濃度呈正相關，黑蒜ABTS+清除率明顯高于白蒜，且隨著樣品濃度的增大清除能力差別明顯。黑蒜加工前后都具有對氧自由基清除能力，但加工后的黑蒜的清除能力顯著高于白蒜。黑蒜在加工過程中多酚含量增加，加工后的黑蒜對DPPH的清除率、還原能力、ABTS+自由基清除率及對氧自由基的清除能力都顯著高于白蒜，表明黑蒜抗氧化能力遠遠高于加工前普通白蒜。本研究結果為黑蒜研究及發展提供了理論依據，并為大蒜市場發展提供了廣闊前景。

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