徐香獼猴桃RNA提取條件及內參基因的優化

趙素平， 胡博然， 胡花麗， 周宏勝， 劉紅艷， 李鵬霞

(1.揚州大學旅游烹飪學院，江蘇揚州 225127； 2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京 210014；3.江蘇省農業科學院園藝產品采后處理工程實驗室，江蘇南京 210014)

高質量的RNA樣品是分子生物學研究的基礎，在總RNA提取時，能否有效地去除果實中的多糖、多酚等物質，并抑制RNA酶活性，是核酸提取效率及核酸質量的重要影響因素[1]。獼猴桃果實含有較多的多糖、酚類物質，由于多糖、酚類物質的干擾，使得獼猴桃RNA提取較其他植物RNA提取的難度大[2]。目前國內外有關提取獼猴桃果實總RNA的方法主要有改進的Lopez-Gomez與Gomez-lim方法[3]、異硫氫酸胍法[4]、HAc-NaAc法[5]、RNA提取試劑盒法等，但是異硫氫酸胍法、試劑盒法比較昂貴，HAc-NaAc法提取需要分離DNA、RNA。本研究在十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法的基礎上進行優化，擬建立1種適于提取獼猴桃果實總RNA的經濟簡便的方法。另外，內參基因的表達量可以對目標基因的表達量進行歸一化和標準化，以減小樣本之間的差異，內參基因在實時熒光定量PCR(qRT-PCR)中起重要作用[6]。相同獼猴桃果實的不同品種、不同部位和不同發育階段等均會對同一基因的表達產生影響，因此，根據果實品種及試驗處理，優化和選擇用于qRT-PCR的內參基因至關重要。本研究以植物常用的內參基因(ACTB、TUB、18SrRNA、GAPDH和Actin)為基礎[7]，擬選擇最適合徐香獼猴桃果實基因表達水平研究的內參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

徐香獼猴桃，購自南京眾彩物流批發市場，挑選大小相近、無病蟲害、無機械損傷、成熟度基本一致的果實進行處理。在處理后的3、6、9 d進行樣品采集，將果肉組織用液氮冷凍，并在 -70 ℃ 下儲存。

1.2 方法

1.2.1 提取液配制 CTAB抽提液成分：2.5%(質量分數)CTAB，2%(質量分數)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，100 mmol/L Tris-HCl[pH值8.0，用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水配制]，25 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，2.0 mol/L NaCl，0.5 g/L 亞精胺，充分混勻后于121 ℃滅菌30 min。使用前加入100 g/L的β-巰基乙醇、三氯甲烷+異戊醇(體積比 24 ∶1)、8 mol/L LiCl、70%乙醇。以上試劑均用0.1%DEPC處理的滅菌雙蒸水配制。

1.2.2 提取方法

1.2.2.1 試劑盒法提取獼猴桃總RNA 嚴格按照試劑盒的要求提取總RNA。

1.2.2.2 優化CTAB法提取獼猴桃總RNA 在傳統CTAB方法[8]的基礎上，進行提取條件的優化。提取步驟：(1)在經過DEPC水處理的無RNA的2 mL離心管中加入1 mL CTAB抽提液，再加入100 μLβ-巰基乙醇，混勻備用。(2)取獼猴桃凍樣置于預冷的研缽中(研缽用乙醇燃燒滅菌后加液氮預冷)，加入液氮，迅速研磨成均勻的粉末，研磨得越細越好；稱取0.4 g磨碎的樣品放入有CTAB抽提液的離心管中，立即混勻，65 ℃水浴30 min(每隔5 min混勻1次)。(3)取出離心管，冷卻至室溫，10 000 r/min、10 ℃離心10 min，取上清放入新的無RNA的離心管中。(4)加入等體積三氯甲烷、異戊醇(體積比為24 ∶1)，于室溫條件下劇烈搖動5 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液加入無RNA的新離心管內，重復此步驟3次至蛋白層不再出現。(5)吸取上清液至無RNA的新離心管中，加入1/2體積8 mol/L LiCl(使其終濃度為4 mol/L LiCl)，于-20 ℃放置過夜(即沉淀時間大于8 h)。(6)將于-20 ℃放置8 h以上的離心管取出，13 000 r/min、4 ℃離心30 min。(7)去除上清，用600 μL 75%乙醇洗滌沉淀，于 13 000 r/min、4 ℃離心5 min，重復此步驟3次，最后一次倒掉乙醇后再空管離心1次，吸出殘留的乙醇，之后在超凈工作臺上放置5 min，使殘留乙醇揮發，以免影響下游試驗。(8)加20 μL DEPC處理的滅菌雙蒸水溶解沉淀，充分混勻，長期保存于-70 ℃。

1.3 總RNA的質量檢測

(1)取2 μL總RNA，用核酸定量分析儀測定并計算D260 nm/D280 nm值、D260 nm/D230 nm值及核酸的濃度，分析其質量與濃度。(2)檢測RNA的瓊脂糖凝膠電泳在1×TAE緩沖液中進行，在3 μL RNA加樣緩沖液(6×loading buffer)中加入 2 μL 總RNA，混合均勻后點樣于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，利用凝膠成像系統觀察RNA的完整性。

1.4 cDNA合成

cDNA的合成嚴格按照First Strand cDNA Synthesis Kit(由Thermo Scientific Revert Aid提供)操作?？俁NA的純化：反應體系含有2 μg/μL RNA，1 μL 10×反應緩沖液(含MgCl2)，1 μL(1 U)DNase Ⅰ(RNase-free)，加入無核酸酶的雙蒸水使總體積至10 μL。反應條件：37 ℃溫育30 min后立即冰浴，之后加入1 μL 50 mmol/L EDTA再于65 ℃溫育 10 min，冰浴5 min后即可進行cDNA合成。

cDNA合成：在上述體系中加入random primer 1 μL，反應總體積調至12 μL。65 ℃加熱5 min后立即置于冰上降溫，之后加入4 μL 5×反應緩沖液，1 μL RiboLock RNase Inhibitor(20 U/μL)，2 μL 10 mmol/L dNTP Mix，1 μL RevertAid M-MuLV RT(200 U/μL)，總反應體系為20 μL。之后于25 ℃孵育5 min，42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育5 min。將合成產物于-70 ℃保存備用。

1.5 獼猴桃內參基因的篩選

內參基因參照張慧琴等的研究[9-10]，詳見表1。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，對5個基因序列進行常規PCR擴增，反應體系：10 μL 2×PCR-Mix，各0.8 μL上、下游引物，0.5 μL cDNA，7.9 μL滅菌雙蒸水，總反應體系 20 μL。反應步驟：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，此步驟35個循環；72 ℃ 10 min。通過半定量PCR和qRT-PCR檢測內參基因ACTB、TUB、Actin、GAPDH、18S rRNA，挑選適合徐香獼猴桃成熟果實檢測的內參基因。

表1 內參基因引物序列

2 結果與分析

2.1 獼猴桃總RNA提取結果

2.1.1 用試劑盒提取獼猴桃貯藏0 d樣品RNA結果 在波長280、230、260 nm下的吸光度依次代表核酸、鹽、蛋白等有機物的含量。高純度RNA的D260 nm/D280 nm值應介于1.8～2.0之間，D260 nm/D230 nm值大于2.0[11]。從表2可以看出，使用試劑盒提取獼猴桃RNA的D260 nm/D280 nm值、D260 nm/D230 nm值整體上分別低于1.8、2.0，這說明RNA中蛋白、多糖等雜質污染嚴重。第3次提取獼猴桃總RNA質量有所提高，但是RNA含量低，不利于進行下游試驗。從圖1可以看出，試劑盒提取獼猴桃總RNA條帶不清晰且彌散，說明RNA有所降解。由圖2可以看出，獼猴桃總RNA條帶清晰但亮度不高，說明RNA含量及純度均較低。因此可知，試劑盒不適合用來提取徐香獼猴桃總RNA。

表2 試劑盒提取獼猴桃RNA的相應結果

2.1.2 CTAB法提取獼猴桃總RNA結果

2.1.2.1 傳統CTAB法第1次提取獼猴桃總RNA結果 以貯藏0 d獼猴桃樣品為基礎設置不同起始質量，進行總RNA的提取。從表3可看出，隨著獼猴桃樣質量的增加，提取的獼猴桃總RNA含量會相應提高，但D260 nm/D280 nm值、D260 nm/D230 nm值也隨之下降，說明提取的總RNA含有多糖、多酚等物質，總RNA質量不高，不適合用于下游分子生物學試驗。

表3 CTAB法提取獼猴桃貯藏0 d樣品RNA的結果

2.1.2.2 第1次優化條件提取獼猴桃總RNA結果 優化條件：獼猴桃樣質量選擇0.5 g，CTAB含量由2.0%提高至2.5%，β-巰基乙醇含量由2%提高到10%，三氯甲烷-異戊醇抽提次數增加至3次。利用優化后的CTAB法提取獼猴桃果實總RNA，用核酸定量分析儀進行檢測。由表4可知，獼猴桃總RNA的D260 nm/D280 nm值基本在1.8～1.9，而D260 nm/D230 nm值介于1.8～2.0，說明總RNA純度提高了，但是仍存在少量多糖、多酚和蛋白質等物質。由圖3的1%瓊脂糖凝膠電泳結果看出，總RNA電泳結果呈現2條帶，且28S的亮度比18S的亮度大，但是18S條帶出現了降解，需要進一步優化提取條件。

表4 第1次優化CTAB法提取獼猴桃總RNA結果

2.1.2.3 第2次優化條件提取獼猴桃總RNA結果 優化條件：樣品質量由0.5 g減少至0.3 g，70%乙醇洗滌次數增加至3次。從表5可以看出，減少獼猴桃提取時的樣品質量，增加乙醇洗滌次數，可以提高總RNA的純度及質量，但D260 nm/D230 nm值仍小于2.0。由圖4可知，獼猴桃總RNA條帶整齊、清晰，但RNA條帶亮度不高，說明RNA樣品含量較低，因此需要進一步優化方法，從而提高獼猴桃總RNA的濃度及純度。

表5 優化CTAB法提取獼猴桃總RNA結果

2.1.2.4 第3次優化條件提取獼猴桃總RNA結果 優化條件：樣品質量0.4 g，LiCl由1/3體積增加至1/2體積，同時LiCl沉淀時間為過夜。通過提高樣品質量至0.4 g，以及LiCl

沉淀過夜提取總RNA，由表6可知，D260 nm/D280 nm值介于 1.8～2.0之間，D260 nm/D230 nm值基本為2.0左右，表明提取的獼猴桃總RNA質量較高。從圖5可以看出，RNA條帶整齊、清晰完整，28S條帶亮度約是18S條帶亮度的2倍，表明總RNA的純度、完整性和產率均較高，蛋白質、多糖及多酚等去除得較徹底，可作為反轉錄的模板。

表6 優化CTAB法提取獼猴桃總RNA結果

2.2 獼猴桃果實內參基因的篩選

2.2.1 半定量PCR篩選獼猴桃果實內參基因 PCR產物用溴化乙錠染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用GelDoc XR(Bio-Rad，美國)照相記錄。對ACTB、TUB、Actin、GAPDH、18S rRNA 5個內參基因進行初步篩選。從圖6看出，將獼猴桃貯藏0 d的cDNA分別加入5對內參引物進行PCR擴增，電泳結果為ACTB和18S rRNA亮度最高，Actin有二聚體，GAPDH沒有表達，TUB亮度相對較低，因此內參初步篩選結果為ACTB、18S rRNA。

由圖7可知，將獼猴桃不同時間和不同處理的cDNA通過分別加入ACTB、18S rRNA、TUB和GAPDH這4對內參引物進行PCR擴增，電泳結果為ACTB、18S rRNA亮度最高且表達較穩定，TUB亮度相對較低，而GAPDH亮度高但表達穩定性不高。

從圖8可以看出，將貯藏0、3 d的CK組、貯藏3 d的處理組、貯藏6 d的CK組、貯藏6 d的處理組、貯藏9 d的CK組、貯藏9 d的處理組的cDNA通過分別加入Actin內參引物進行PCR擴增，電泳結果顯示Actin引物均有二聚體，不適合作為徐香獼猴桃的內參基因。

2.2.2 實時熒光定量PCR檢測ACTB、TUB和18S rRNA 由表7可知，TUB的CT值基本在32以上，說明TUB基因基本不表達，18S rRNA的CT值介于8.0～11.0之間，值相對偏低，不適宜作為徐香獼猴桃果肉的內參基因，而ACTB的CT值介于19.0～24.0之間，表達穩定性相對較高，因此選擇ACTB作為熒光定量PCR的內參基因。

3 討論

3.1 優化CTAB法提取徐香獼猴桃總RNA

優化后的CTAB法所用試劑均是常規試劑，可有效降低試驗成本[12-13]。本研究中優化CTAB法的關鍵：(1)提取獼猴桃總RNA時樣起始量不能太大，否則提取液不能完全消化獼猴桃內的物質，優化后選取的樣品質量為0.4 g。(2)CTAB含量由2.0%提高到2.5%，CTAB是蛋白質的變性劑，提高CTAB含量可以有效去除果實中的蛋白質。(3)提取液中β-巰基乙醇含量由2%提高到10%，可以變性蛋白，有效抑制RNA酶的活性[14]，同時，β-巰基乙醇作為有效還原劑，能有效抑制酚類物質及內源酚的氧化，防止褐化效應發生，提高RNA提取質量。(4)三氯甲烷-異戊醇抽提次數增加至3次，三氯甲烷和異戊醇混合液使蛋白質變性、分層，且可以去除脂類，還可使有機相和無機相迅速分離，從而有效回收RNA。(5)LiCl由1/3體積增加至1/2體積，高濃度LiCl在選擇性沉淀RNA的同時，可使多糖留在溶液中而不隨RNA沉淀下來[15]。LiCl沉淀需要在4 ℃放置過夜，時間長，但是RNA的產率高，且RNA純度高，從而降低了RNA降解的概率。LiCl本身沉淀大片段RNA效果好的特點使得到的RNA大片段損失很少，更適于進行后續的分子生物學試驗[16]。(6)70%乙醇洗滌增加至3次。多次乙醇洗滌可有效去除多糖，同時高濃度的NaCl也有助于去除多糖[17]。(7)加入 0.5 g/L 亞精胺可以有效抑制RNA酶活性。基于以上優化后的CTAB法提取的獼猴桃總RNA，完全可以滿足 RT-PCR、Northern Blotting等分子生物學試驗的要求。

表7 ACTB、TUB和18S rRNA qRT-PCR結果

注：CT表示從基線到指數增長拐點所對應的循環數。

3.2 徐香獼猴桃內參基因的優化

選擇一種或多種參考基因作為內參基因用來分析qRT-PCR基因的表達，同時參考基因需要不受試驗條件的影響[18]。qRT-PCR分析最常用的參考基因包括Actin、18S RNA、GADPH、TUB等[19]。有研究表明，相同植物的不同品種、不同組織器官以及相同組織器官在不同發育階段，同一基因的表達均會出現差異[20-21]。因此，根據獼猴桃的品種及不同的處理方式，選用合適的內參基因對其他基因的表達水平進行歸一化，才能對試驗結果進行正確判斷與比對。隨著分子生物學研究的廣泛開展和不斷深入，基因表達分析已經廣泛應用于獼猴桃基因代謝調控機制的研究中，因此篩選穩定的內參基因在基因表達分析中起著關鍵作用[22]。

張慧琴等發現，TUB和ACTB在華特獼猴桃6種不同組織中表達均穩定，適合作為華特獼猴桃不同組織基因表達的內參基因[9]。本試驗通過半定量PCR檢測ACTB、TUB、Actin、GAPDH、18S rRNA這5個內參基因可知，ACTB在徐香獼猴桃果實中表達最穩定。由本研究結果可知，通過熒光定量PCR進一步確定ACTB適合作為徐香獼猴桃果實的內參基因。因此，通過半定量PCR、qRT-PCR最終選擇ACTB作為徐香獼猴桃果肉的內參基因，用于實時熒光定量PCR分析。這些研究結果可為下一步揭示徐香獼猴桃衰老機制研究提供有力的試驗方法。

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