間充質干細胞旁分泌作用對外分泌腺腺體損傷后功能恢復的研究進展

曹璐 綜述 王帥 張霓霓 黃桂林 審校

【提要】 各種物理性、機械性、化學性和病原微生物性的刺激均可能導致外分泌腺腺體的損傷，從而使其分泌功能下降。外分泌腺腺體損傷后藥物治療的效果有限，器官移植風險大且供體不足。而間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）因其強大的增殖能力、多向分化能力及旁分泌/自分泌作用，為修復各種外分泌腺損傷提供了一種新思路。本文就MSCs的旁分泌作用在外分泌腺組織工程中的應用及研究進展進行綜述。

外分泌腺（Exocrine gland）是一類有導管（單細胞腺無導管）的腺體，其分泌物不進入血液，而由導管流出，如肝臟產生膽汁，通過膽總管流到十二指腸。唾液腺、汗腺、皮脂腺、腸腺、肝等均屬于外分泌腺。胰腺是一種比較特殊的腺體，其外分泌部能產生胰液，由胰管流入十二指腸，屬外分泌腺。而內分泌部是分布于胰腺中的小島，叫胰島，由A、B、C、D四種細胞組成，如B細胞能產生胰島素，A細胞能產生胰高血糖素，由體內的血管運送到全身各處，所以胰島屬于內分泌腺。各種物理性、機械性、化學性和病原微生物性的刺激均可能導致外分泌腺腺體的損傷，從而導致其分泌功能的下降。

1 間充質干細胞

間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）可在各種組織中形成異質性多能性基質細胞群，具有多向分化能力[1]，因此MSCs對組織損傷的修復作用已被廣泛應用于急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、心肌梗死、心肌瘢痕、肺損傷、軟骨和骨骼損傷、皮膚和神經組織損傷等研究中[2-6]。MSCs可通過表面分子及功能特征的組合來識別，表達CD13、CD29/ITGB1、CD44、CD73、CD90、CD105 和 CD106/VCAM-1， 通常缺乏造血 表 面蛋白 CD31/PECAM-1、CD34、CD45/LCA 和 CD11b[6]。迄今為止，還沒有一種獨特的MSCs表面標志物被普遍應用于鑒定，還需以附加的功能特征來表征，如細胞呈紡錘樣形態，黏附在塑性表面的能力及造血、成骨、成脂的分化潛能。即使通過高劑量的電離輻射后，MSCs形態仍保持穩定，分化潛能、細胞凋亡水平、黏附和遷移能力均不受明顯影響[7-9]。

2 MSCs旁分泌作用

一般認為，MSCs發揮作用的機制為轉分化、細胞融合、旁分泌效應、攜帶mRNA或miRNA和線粒體轉移等。既往認為，干細胞主要作為種子細胞經移植后在體內分化為靶組織細胞，或與靶組織細胞發生融合從而達到修復的目的。但近年來的實驗證實，成體干細胞植入缺血組織后并未分化成相應的心肌、內皮、腎小管上皮等靶組織細胞，而是通過促增殖、抗凋亡、抗炎等效應，顯著改善了缺血后組織的功能[10-12]。MSCs被發現通過分泌細胞因子、生長因子和其他旁分泌因子，在損傷器官中形成具有支撐作用的微環境，進而支持其他類型細胞在病變組織中再生[6]。

MSCs的旁分泌效應，被認為是最全面和持久的作用模式。有研究認為，MSCs條件培養基（MSCs-CM）可刺激內皮細胞（ECs）和平滑肌細胞的生長，這種現象可通過MSCs-CM中檢測到高水平的VEGF和bFGF來解釋，但使用抗VEGF和抗bFGF抗體中和只能部分地削弱這種效應，表明除VEGF和bFGF外還有其他潛在的有益趨化因子或細胞因子需要確定，如免疫調節因子、抗炎抗凋亡及抗氧化因子等[5]。Selmani等[13]發現，由MSCs分泌的HLA-G5，可使MSCs對 T淋巴細胞和NK細胞具有免疫抑制作用。研究證明，MSCs可抑制樹突細胞（DC）來源的CD14+單核細胞的分化、成熟及功能，從而抑制T淋巴細胞免疫應答；還可誘導CD4+CD25高表達，從而調節T細胞。除對淋巴細胞的影響外，MSCs的生物活性成分還可促進巨噬細胞從促炎表型M1（經典活化的巨噬細胞）轉變為抗炎癥表型M2（替代激活的巨噬細胞）[14-15]。為了防止程序性細胞凋亡，MSCs合成和分泌了經典的細胞凋亡抑制劑蛋白，如Bcl-2、survivin和Akt。MSCs除直接合成抑制細胞凋亡的蛋白外，還能分泌細胞因子，抑制凋亡途徑或提高存活率（如VEGF可通過上調Bcl-2或通過抑制p53介導的細胞凋亡而起到抗凋亡的作用）[16]。當氧化反應旺盛時，會發生以下過程：炎癥細胞浸潤、蛋白酶的釋放及ROS等氧化副產物的積累。而MSC衍生的Stanniocalcin（stc1）可減少ROS相關的細胞凋亡，表明其在抗氧化活性方面的作用[17-18]。

研究發現，間充質干細胞移植治療存在一些安全隱患，如易成瘤、免疫抑制、植入率分化率低、血管栓塞等不良反應。另外，要獲得足夠的干細胞數量需進行傳代培養，但干細胞多次傳代后生物學特性可能會發生改變，出現干細胞老化、癌變等不良后果[19-21]。研究證實，MSCs衍生的條件培養基或外泌體在修復受損組織中具有抗炎和調節免疫的作用[22]。

MSCs-CM是MSCs在培養過程中產生的上清液，含豐富的生長因子、細胞因子、生物活性因子和組織再生劑等[23-24]。MSCs衍生的細胞外囊泡（EV），包括外泌體（Exosome）和微泡（MV），已被證明在MSC細胞療法中的作用，這些囊泡參與細胞間的通訊、細胞信號傳導以及改變細胞或組織的代謝[25-27]，MSC-Exo中的蛋白或RNA能調節細胞的增殖分化，并促進細胞歸巢作用，從而促進損傷修復及組織再生[28-29]。與MSCs移植相比，MSCs-CM及外泌體更方便儲存和運輸，且避免了許多細胞移植的相關風險，更具安全性[29]。Damania等[30]證明，MSCs來源的外泌體對干細胞沒有任何細胞毒性，減少了由于損傷條件而產生的氧化應激，同時顯示出更好的細胞保護性及細胞活性。MSC-Exosome在骨損傷、皮膚損傷、神經損傷及肝損傷等的修復上都具有積極的作用[31]。

在局部損傷、炎癥、缺氧等刺激的誘導下，可促進MSCs旁分泌因子的釋放。王丹等[32]證實了輻射預處理MSCs可以破壞其分化能力，但保留旁分泌能力，當＜4 Gy劑量的60Co γ射線輻射后VEGF及bFGF水平無明顯降低，與未經輻射的對照組相比無明顯統計學差異，而≥4 Gy劑量輻射后 MSCs的Ⅷ因子陽性率顯著降低，說明其分化能力受損。該實驗證明4 Gy劑量的60Co γ射線既不影響 MSCs的旁分泌功能，同時又能抑制其分化能力，為后期研究MSCs的旁分泌實驗細胞模型的建立提供一個新思路。

3 MSCs旁分泌在外分泌腺損傷中的作用

3.1 唾液腺損傷

大約有70%接受頭頸部放療的患者因主要的幾個大唾液腺靠近腫瘤原發灶和淋巴結位點經常被照射，導致唾液腺功能逐漸喪失，從而直接或間接影響患者的生活質量。并發癥包括味覺喪失、灼口癥、齲齒和其他口腔傳染病，以及吞咽困難、發音障礙，甚至導致心理疾病。改進放療技術、放療前轉移頜下腺，以及促涎劑的使用等仍無法實現對唾液腺功能長效的改善[33-34]。

頭頸部放療通常會導致唾液腺發生不可逆性的損傷。Stiubea-Cohen等[35]證實，在輻射后12周，唾液分泌逐漸減少到初始水平的50%，通過蛋白質組學質譜（MS）分析后進一步檢測了唾液蛋白質組合物，結果顯示來自下頜下腺（SSG）的蛋白質表達減少，而來自血清的蛋白質表達增加，兩者均提示唾液腺組織的損傷。為了檢查mRNA表達水平的變化，進行了微陣列分析，發現95個基因有著顯著變化，包括細胞周期阻滯基因、SG功能基因和DNA修復基因等。

Shin等[36]將人腮腺上皮細胞與hADMSC進行3D共培養。結果表明，低氧預處理hADMSCs保護唾液腺免受輻射誘導的細胞凋亡，并通過hADMSC旁分泌因子（包括FGF10）的作用激活FGFR-PI3K信號來保持腺泡結構和功能。An等[37]將hADMSC分離、擴增并暴露于低氧條件下（O2＜5%），將缺氧條件培養基過濾至高分子量級，并制備成hADMSC分泌物。實驗證實，條件性hADMSC分泌物含有高水平的GM-CSF、VEGF、IL-6和IGF-1，與對照組相比，用 hAdMSC分泌物重復輸注，唾液分泌能力增強，同時唾液蛋白（包括淀粉酶和EGF）的水平增加，且SG的顯微結構完整性得以保存，并保護唾液上皮（AQP-5）、內皮（CD31）、肌上皮（α-SMA）和 SG祖細胞（c-Kit）免受輻射損傷。同時，實驗還證明缺氧預處理可促進hADMSC的抗凋亡作用。

3.2 汗腺、皮脂腺損傷

研究認為，MSCs介導的傷口愈合涉及多種機制，包括抗炎、抗菌、免疫調節和組織修復活動[38]。皮膚及其附屬器（如毛囊、皮脂腺、汗腺）在皮膚的基本功能中發揮著重要的作用，如熱調節、感覺和潤滑等，由于受傷或燒傷可能會導致局部或全層的損傷。在全層皮膚缺損的情況下，汗腺及皮脂腺不可再生，導致分泌功能喪失。皮膚再生是一個動態且復雜的過程，需要一系列涉及表皮細胞、皮膚細胞、生長因子、細胞外基質（ECM）、受損部位神經、血管的協調相互作用。Wu等[29]證實，MSC-Exosomes能夠通過傳遞Wnt4及轉運Wnt11來激活皮膚細胞中Wnt/β-catenin途徑，以促進皮膚傷口愈合并在損傷后恢復皮膚完整性。Padeta等[39]利用MSC-CM在背部燒傷大鼠模型中進行局部治療，結果顯示MSC-CM可促進大鼠皮膚燒傷創面的恢復。

李倩坤等[40]利用定量紫外線照射人永生化表皮細胞（Ha-CaT）構建表皮細胞光老化模型，培養人絨毛膜間充質干細胞（CDSCs），將不同濃度的 CDSCs上清液（CDSC-CNM）作用于光老化表皮細胞，結果顯示CDSC-CNM對光老化表皮細胞有修復再生作用，可有效增強細胞活力、減少ROS生成量，并減輕DNA損傷程度，有望用于治療大面積汗腺損傷患者。

3.3 胰腺、腸損傷

放射治療在惡性骨盆腫瘤中具有至關重要的作用，腸對放射線非常敏感，接受放療的腹部惡性腫瘤患者（10%～20%）在治療結束后數年發生腸道并發癥，輻射產生自由基，通過直接和間接的作用，誘導隱窩細胞的凋亡，導致黏膜損傷并喪失上皮屏障能力。動物模型實驗已證明，靜脈內（IV）注射MSC可減少由電離輻射引起的嚴重的結直腸損傷，IV-MSC治療促進了上皮再生從而使腸組織結構改善，同時限制纖維化過程[41-43]。

劉婉薇等[44]通過炎癥預激活BMSCs條件培養基對急性輻射損傷小腸上皮進行治療，結果表明炎癥激活狀態下的BMSCs條件培養基可促進輻射損傷小腸結構和功能的修復。鄭躍等[45]通過缺氧誘導也得到相同結論。Pouya等[46]將MSCCM注射小鼠急性結腸炎模型，發現小鼠體重減輕癥狀緩解、血便減少、大便黏稠度改善，發現其上皮細胞損傷、杯狀細胞破壞、彌漫性纖維化、隱窩破壞和炎癥細胞浸潤顯著減輕。劉敏等[47]將MSCs培養上清作用于急性胰腺炎大鼠模型，顯示其胰腺組織病理損傷減輕，IL-6及TNF-a水平明顯減低。

3.4 肝臟損傷

肝臟具有強大的自我修復和再生能力，該特性使肝臟免受食物毒素引起的毀滅性的肝臟損傷，但發生急性肝功能衰竭（ALF）時，常導致患者死亡。肝移植是首選治療方法，但存在器官捐獻者短缺、費用昂貴、倫理學限制、需長期服用免疫抑制劑等問題，這使得干細胞移植成為治療該疾病的新希望[48]。

Xu等[49]的研究表明，MSC-CM可通過抑制細胞凋亡和調節miRNA表達，從而減輕H2O2誘導的氧化應激肝損傷。此外，miR143的下調可保護人類肝細胞系L02細胞免于凋亡，并通過調節HK2 ADRB1和凋亡相關蛋白的表達啟動抗凋亡過程。Chen等[50]在MSC-CM修復輻射性肝損傷的體內及體外實驗中，觀察到MSC-CM抑制輻射誘導的SD大鼠肝竇狀內皮細胞（Sinusoidal endothelial cell，SEC）凋亡，肝組織切片顯示MSC-CM預處理組的竇性充血和脂肪變性顯著減少，血清透明質酸 （Hyaluronic acid，HA） 顯著下降，TNF-α、IL-1β和IL-6的表達降低而IL-10的表達增加。總之，MSC-CM治療對SEC凋亡和炎癥反應調節具有顯著的抑制作用，最終改善經受輻射誘導的大鼠肝損傷。Damania等[30]利用富含外泌體的分級分泌蛋白質組修復肝損傷的體外模型，結果證實外泌體的抗凋亡/促存活及抗氧化等作用，臨床可用于肝移植病例以減少缺血/再灌注損傷相關的組織損傷或用于治療急性肝衰竭。

4 展望

MSCs作為一種來源豐富的種子細胞，在外分泌腺的損傷修復中發揮著巨大的作用，研究證實旁分泌作用是其主要的修復機制，未來或許可以利用條件培養基或外泌體等代替細胞對外分泌腺損傷進行修復，并可進行大批量、標準化生產。隨著組織工程的發展及研究的深入，間充質干細胞的旁分泌作用會在外分泌腺損傷修復方面占據更重要的地位。