脂肪干細胞來源外泌體促進組織修復的應用進展

陳筑昕 綜述 周雙白 李青峰 審校

【提要】 脂肪干細胞具有促進組織修復再生的作用，作用機制與其旁分泌作用密不可分。外泌體是一種細胞分泌的外囊泡結構，是細胞之間通訊的新機制。近年的研究發現，干細胞來源外泌體是干細胞旁分泌活動的一種重要方式，介導其促進組織再生。外泌體的應用為組織修復提供了一種新策略，本文對脂肪干細胞來源外泌體應用于組織修復的研究進展進行綜述。

細胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs），是機體內細胞經胞吞作用形成多泡小體后，通過細胞膜融合分泌到細胞外環境中的微小囊泡[1]。根據囊泡直徑大小，可將EVs分為三類：凋亡小體（＞1 000 nm）、微囊泡（100～1 000 nm）、外泌體（Exosome，30～100 nm）。 EVs可從干細胞等多種細胞中釋放，也可被多種細胞攝入，含有與母細胞相似的生物活性物質，包括RNA、DNA、蛋白質、脂質及完整的細胞器（如線粒體）等。其中，外泌體可參與調控機體正常生理功能和異常病理過程，被認為是細胞之間通訊的新機制[2]。脂肪干細胞（ADSCs）具有和骨髓間充質干細胞（BMSCs）相似的表面標記、基因表達譜和生物學功能[3-5]。但目前干細胞發揮作用的機制尚不明確。近年來的研究表明，干細胞所發揮的組織修復與再生功能，不僅因其在損傷部位的增殖和分化，很大程度上是由其旁分泌作用實現的[4-5]。ADSCs可分泌直徑20～100 nm的脂質雙層膜包裹結構的亞細胞顆粒，稱為脂肪干細胞來源外泌體（Adipose stem cells derived exosome，ADSCs-exo）。ADSCs-exo與ADSCs相比，具有更多的優勢：性質更穩定，易于保存，便于管理及運輸；不含活細胞，是無細胞治療的基礎；生物學功能不隨時間延長而衰減；低抗原性，同種異體應用不會引起免疫反應[6]。

因此，目前廣泛開展了對外泌體的成分、形成機制、作用機制和功能的研究。本文將對ADSCs-exo與組織修復相關的最新研究進展、潛在分子機制及其未來發展方向進行綜述。

1 外泌體的生物學特性及功能

外泌體是細胞經過“內吞-融合-外排”等一系列調控過程形成的直徑30～100 nm、密度為1.13～1.19 g/mL的膜性脂質囊泡，透射電鏡下觀察具有典型的“杯口狀”形態，幾乎所有細胞類型在各種生理和病理條件下分泌[7]，內含有功能性蛋白質、mRNA及microRNA等物質，在細胞間的信息傳遞過程中發揮重要作用。

研究表明，不同來源的外泌體蛋白既有共同之處也有特異性[8]。外泌體所含的共同蛋白與其形成過程有關，這些蛋白來自分泌細胞膜及高爾基體和內質網的生物膜等。有與細胞骨架組成相關的分子：四次跨膜蛋白超家族 （如CD63、CD9和 CD81），熱休克蛋白（HSP70、HSP90）等，這些蛋白在幫助外泌體進出細胞過程中發揮重要作用，也因為這些蛋白的保守型，將其作為表面標記來鑒定體外分離得到的外泌體。在特異性方面，病理狀態下細胞釋放的外泌體與正常狀態下細胞釋放的外泌體是存在差異的[9]。研究顯示，人類免疫缺陷病毒感染后的T淋巴細胞和EB病毒感染后的B淋巴細胞釋放的外泌體內含有病毒編碼物質，其機制暫時未被闡明，但可能與病理狀態下細胞的高代謝活性相關[10]。

過去認為外泌體是細胞處理的冗余細胞成分，但越來越多的研究證明，外泌體通過細胞間轉移核酸、蛋白質、脂質的特定物質，參與機體的各種生理或病理的過程，如抗原呈遞免疫反應、腫瘤轉移、蛋白清除、基因交換等[11-12]。外泌體進入靶細胞的途徑有三種：通過靶細胞胞吞作用被攝入到細胞內；通過細胞膜融合的方式與靶細胞膜融合，直接釋放其中含有的物質及信息到靶細胞；通過膜表面與靶細胞膜表面的受體-配體高效率的結合，將細胞外信號傳遞到細胞內，從而進行信息交流。最新研究表明，外泌體還可作為載體將抗腫瘤藥物紫杉醇包被，并靶向遞送至腫瘤細胞，從而提高化療藥物紫杉醇對耐藥腫瘤細胞的治療效果[13]，藥物經外泌體包封后藥代動力學發生了變化，藥物在體內的半衰期延長，毒副作用減少，治療效果得到提高[14]。

2 間充質干細胞來源外泌體在組織修復中的相關研究

外泌體不僅體現來源細胞的分化方向，還體現來源細胞的生理病理狀態，是因為其所含的miRNA是細胞間交流的主要調節物質，能夠通過自身的降解和再表達來調節受體細胞的基因表達。細胞中RNA的表達譜特征不具有供體和組織特異性，然而外泌體中所含的RNA卻較大程度地受細胞類型和分化狀態的影響，不同組織來源的外泌體具有不同的性能。間充質干細胞來源外泌體 （Mesenchymal stem cells derived exosomes，MSC-exo）中的RNA或者蛋白能夠發揮細胞歸巢作用，并調節細胞的增殖與分化，可以限制損傷、調節免疫反應以及促進細胞損傷后的自我修復和組織再生[15-17]。Baglio等[16]分離由人骨髓和脂肪間充質干細胞分泌的外泌體，并通過電子顯微鏡標記、蛋白分析、RNA測序等方法，證實人骨髓和脂肪間充質干細胞分泌的外泌體富含特異性miRNA和tRNA。Quesemberry等[18]提出，MSC-exo扮演著干細胞生物學上的關鍵角色，推測外泌體在免疫調節、促血管形成及促進細胞新生方面有重要作用。

2.1 免疫調節

Zou等[19]發現，MSC-exo可降低巨噬細胞趨化蛋白CX3CL1及腫瘤壞死因子（TNF）的表達，同時上調白細胞介素-10，降低局部炎癥反應，起到免疫調節的作用。Kordelas等[20]的研究表明，MSC-exo可降低難治性抗移植物抗宿主病患者體內的白介素-1β、TNF-α及γ-干擾素水平，調節機體免疫，促進受損組織修復。

2.2 促血管新生

研究證明，來自內皮祖細胞的外泌體，攜帶有促血管生成的miRNA（如 miR-126、miR-296和let-7等），能夠在靜止的內皮細胞中通過水平轉移RNA激活血管形成[21-22]。將MSC外泌體與血管內皮細胞體外共培養，MSC-exo可被血管內皮細胞攝取并內化，RT-PCR發現培養后的血管內皮細胞同樣高表達MSC-exo攜帶的促血管化miRNA[23]。人臍帶MSC-exo與體外培養的人臍靜脈內皮細胞共培養時，內皮細胞成管狀結構更加明顯，內皮細胞遷移更加良好[24]。

2.3 促進細胞增殖、抑制細胞凋亡

在甘油誘導的嚴重聯合免疫缺陷 （Severe combined immune deficiency，SCID）鼠急性腎損傷模型中發現，骨髓MSC-exo具有保護腎功能的作用[25]，其修復能力與其母體細胞無顯著性差異，可通過上調bcl-xl、bcl2、birc8等抗凋亡基因，下調Casp1、Casp8、LTA等促凋亡基因，同時活化細胞外信號調節激酶，以促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，從而發揮組織修復作用。此外，MSC-exo可通過向靶細胞轉運RNA，誘導靶細胞合成肝細胞生長因子（HGF）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）等，激活信號通路，調控靶細胞的細胞周期活動，最終促進其增殖[26]。Ko等[27]的研究表明，靜脈輸注ADSCs-exo可抑制大鼠模型的肝癌細胞的生長，認為與NKT細胞有關。但是，孫昭等[28]認為，ADSCs-exo下調結腸癌細胞系HCT8上皮相關標志物的表達，上調間質相關標志物的表達，因而促進HCT8的遷移和侵襲。在乳腺癌細胞系遷移方面，ADSCs-exo也被認為可將Wnt信號通路激活，促進乳腺癌細胞系MCF7的遷移[29-30]。

3 ADSCs-exo應用于促進組織再生的研究進展

近年來發現，ADSCs-exo與ADSCs分泌的生長因子、趨化因子、脂質等多種活性物質近似，可能也具有相似的生物活性[31-33]，可促進血管內皮的增生。血小板衍生的生長因子可促進ADSCs釋放增強血管生長潛力的外泌體[1]。

3.1 神經系統疾病的修復

魏俊吉等[34]用PC12細胞（鼠嗜鉻細胞瘤細胞系）建立谷氨酸神經細胞損傷模型，用ADSCs-exo處理損傷細胞，結果顯示外泌體中含有大量的對大腦損傷有一定保護作用的細胞因子（如胰島素生長因子和肝細胞生長因子），能夠提高損傷細胞的存活率，其作用機制可能是外泌體通過PI3K-Akt通路實現對神經損傷的保護作用。另有研究發現，ADSCs-exo能夠攜帶高水平的腦啡肽酶，具有治療阿爾茲海默病的潛能[35]。阿爾茲海默病一種神經退行性病變，其特征性表現是β-淀粉肽在腦中沉積，腦啡肽酶是腦中最重要的β-淀粉肽降解酶。ADSCs-exo與高表達β-淀粉肽的成神經細胞瘤細胞共培養時，能夠降低細胞內、外的β-淀粉肽，表明ADSCs-exo有助于β-淀粉肽的清除。此外，ADSCs-exo釋放一系列神經因子，如腦源性神經營養因子、神經生長因子和神經膠質衍生神經營養因子等，可促進神經元修復并刺激神經組織再生。Chen等[36]發現，ADSCs-exo的聯合治療可減少大鼠急性缺血性卒中的梗死面積，促進神經功能恢復。

3.2 心臟損傷修復

Cui等[37]的報道顯示，ADSCs-exo可通過轉運microRNA改善心肌缺血，顯著降低因心肌缺血引起的心肌梗死，同時肌酸激酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）和心肌肌鈣蛋白Ⅰ的水平降低。同時，ADSCs-exo拮抗心肌細胞凋亡，通過Bcl-2的上調和Bax的下調，對心臟功能產生保護作用。

3.3 腎損傷修復

Lin等[38]應用小鼠腎臟缺血再灌注模型，比較ADSCs、ADSCs-exo以及兩者聯合應用的效果，發現單獨應用外泌體即可減輕腎缺血再灌注損傷，兩者聯合應用比單獨應用干細胞更能減輕腎臟功能的惡化和保護腎結構的完整性，并認為外泌體能轉運特殊的mRNA分子，激活AKt及ERK信號通路，抑制凋亡基因Bax、Caspase3/7的表達并激活細胞幸存信號，使Bcl－2表達上調，從而促進腎臟細胞增殖。

3.4 骨組織修復

Li等[39]報告了一種新型無細胞組織工程骨的構建和評估。他們將hADSCs的外泌體與PLGA支架結合，成功加速了小鼠顱骨缺陷的修復。他們將ADSCs-exo固定在聚多巴胺包被的PLGA/PDA支架上，研究ADSCs-exo對人骨髓干細胞的成骨、增殖和遷移能力的影響，并通過成骨誘導優化其骨誘導作用。體外實驗表明，ADSCs-exo可以從PLGA/PDA支架上緩慢地持續釋放；體內實驗結果表明，這種無細胞體系顯著增強了骨再生，在新形成的骨組織中至少部分通過其骨誘導作用和促進間充質干細胞遷移和歸巢作用。種新型無細胞系統由ADSCs-exo和PLGA/PDA支架組成，為骨組織工程提供了新的研究思路，顯示了修復骨缺損的潛力。宋子珺等[40]研究了ADSCs-exo對低氧缺血情況下骨細胞凋亡的影響。缺血是造成骨細胞凋亡的主要原因，低氧缺血環境協同促進骨細胞凋亡，ADSCs-exo可有效抑制低氧缺血環境誘導的骨細胞凋亡，提示ADSCs-exo可以促進骨組織修復與再生。Tofino-Vian等[41]指出，ADSCs-exo可以緩解骨關節炎的炎癥刺激。ADSCs-exo下調白介素-1β，減少了炎癥介質的產生，對白介素-6和前列腺素E2的影響最大，可以調節炎癥和氧化應激，對異常成骨細胞代謝進行矯正，從而緩解骨關節炎。

3.5 皮膚及創面修復

Hu等[42]發現，ADSCs-exo能夠以劑量依賴性的方式刺激成纖維細胞的增殖、遷移和膠原蛋白合成，并促進細胞周期蛋白1、N-鈣黏蛋白、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和增殖細胞核抗原的表達，從而促進皮膚傷口的愈合。Kang等[43]進一步研究發現，ADSCs-exo通過傳遞miR-31促進內皮細胞的遷移和血管生成。其中的一個抗血管生成基因HIF-1，被認定是miR-31在血管內皮細胞的靶向基因。Liang等[44]研究表明，ADSCs-Exo可傳輸miR-125a到內皮細胞，降低血管生成抑制劑DLL4的表達，促進血管內皮尖端細胞的形成，調節內皮細胞血管生成作用。Pu等[45]認為，ADSCs-exo對缺血再灌注損傷的修復有明顯作用，可促進皮瓣存活并增加毛細血管的密度。

4 總結與展望

ADSCs-exo促進組織修復和再生，主要是通過傳遞ADSCs來源或自身特異性包裝的蛋白、脂質、mRNA和miRNA等物質，并介導旁分泌通路以及所需的營養因子和炎癥因子，使損傷組織中的細胞重新進入細胞周期[46]。ADSCs-exo可以避免干細胞治療的免疫排斥、倫理問題等缺點，且具有高穩定性、易于儲存、無需增殖、便于定量使用等優勢，與單一的細胞因子比較，具有較高的安全性和更大的組織再生潛能[6]。

目前，ADSCs-exo的研究尚在初期階段，還需對ADSCsexo介導的促進組織再生治療機制進行深入的研究。因此，未來對ADSCs-exo的研究將不僅僅關注其治療潛能，更應對相關的安全性進行評估。

總之，隨著對ADSCs-exo研究的深入，其在促進組織再生中的應用和機制將更清晰，在組織缺損和修復重建中具有巨大的臨床應用前景。