RNA干擾技術的原理與應用研究

目的：探究RNA干擾技術的原理與應用。方法：選擇Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色譜柱，直徑分別為4.6×300mm、2.1×30mm，流速分別為≤0.35mL/min、0.05～0.075mL/min，柱溫分別為<60℃、20℃～25℃，pH范圍分別為2～12、2.5～7.5，流量參數分別0.3mL/min、0.075mL/min，分子退出系數為170 200，樣品總體積500μl，鹽酸小檗堿濃度10、15、20、30、40pmol/μL；給予HPLC級乙腈、HPLC梯度級水以及P4417SIGMA磷酸鹽緩沖鹽水（0.01M），檢測波長260nm，經由體積排阻色譜法分析檢測。結果：不同濃度下，濃度與峰高之間呈正比關系，R2=0.9302，方程y=5.069x-14.172。結論：采用不同色譜柱及鹽酸小檗堿用于評估RNA干擾技術的應用效果較好。

RNA技術在制藥產業應用范圍較廣泛，比如乳腺癌、腦部膠質瘤等惡性腫瘤、以及遺傳性疾病等。由于制藥涉及的原理及機制比較復雜，類型較多，比如反義寡核苷酸、小干擾RNA等，但由于RNA藥物修飾、傳遞及免疫激活等方面尚未完全研究清楚，因此需進一步研究[1-2]。鹽酸小檗堿是一種生物堿，具有抑菌作用，能夠有效清除毒素，作為寡核苷酸修飾后產物，屬于臨床常用藥，可單用，也可作為添加于其他藥物，作為一種藥物成分[3-4]。本次研究選擇Dionex Ultimate3000型色譜儀，分別選擇Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色譜柱，經由體積排阻色譜法進行檢測，分析檢測結果，獲得一定研究成果，現報告如下。

資料與方法

設備與試劑

本次研究選擇Dionex Ultimate3000（Thermo Scientific制造）型色譜儀，分別選擇Acclaim SEC-300（5μm，分析范圍4.6×300mm，由Thermo Scientific制造）及MAbPac SEC-1色譜柱（5μm，分析范圍2.1×300mm，由Thermo Scientific制造），濃度測量儀器為Nanodrop2000（Thermo Scientific制造），離心機為Thermo Legend Micro17離心機，20μL環形Nano Viper/彩色PEEK管（內部直徑為0.18mm），震蕩攪拌機，Mettler toledo 320 pH計；主要化學試劑如下：HPLC梯度級水（Fisher Scientific制造，英國），HPLC級乙腈（Fisher Scientific制造，英國），P4417 SIGMA磷酸鹽緩沖鹽水（片劑，一片溶于200mlHPLC水中，得到0.01M磷酸鹽緩沖液）；鹽酸小檗堿（產品編號GZDD-0060，CAS號633-65-8，質地純度≥98.837%，來自貴州迪大科技有限責任公司，常規包裝30mg）。

方法

本次研究選擇Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色譜柱，其直徑分別為4.6×300mm、2.1×30mm，流速分別為≤0.35mL/min、0.05～0.075mL/min，柱溫分別為<60℃、20℃～25℃，pH范圍分別為2～12、2.5～7.5，流量參數分別0.3mL/min、0.075mL/min，平衡時間分別為50min、42min；給予HPLC級乙腈、HPLC梯度級水以及P4417SIGMA磷酸鹽緩沖鹽水（0.01M），檢測波長260nm，經由體積排阻色譜法進行檢測，分析檢測結果。檢測方法如下：1）吸取HPLC梯度級水（5μL）轉移至設備頂部，合上裝置臂，再次打開后，擦拭頂部HPLC梯度級水，重復2～5次，保證設備頂部足夠干凈；2）進入系統設置后，選擇計算機系統中的寡核苷酸計算模式，輸入序列后，得到分子量及分子退出系數等實驗基礎參數；3）鹽酸小檗堿檢測樣品濃度10、15、20、30、40pmol/μL；測試鹽酸小檗堿樣品前，以2μL HPLC梯度水作為實驗的空白對照組，開始樣品濃度測試，每次吸取樣品2μL；實驗結束后，儀器頂部同樣使用HPLC梯度級水清洗；準備好樣品（單個樣品總體積500μl，最大濃度400pmol/μl）、制備緩沖液，設定濃度為5pmol/μl；-20℃條件下保存于冰凍箱內；檢測時，將樣本取出后放置于室溫下，直至樣品完全融化后，經渦旋混合器混合、經離心5min后，去除氣泡，再繼續其余實驗步驟；層析寡核苷酸樣品，自動取樣針依次吸取PBS緩沖液、鹽酸小檗堿樣品、PBS緩沖液；每個緩沖液均需在脫氣15min后再與色譜系統相連，在實驗中持續關注PBS緩沖液情況，PBS緩沖液需及時更換，但不得中斷，保證色譜柱不干燥[5-7]。

結果

鹽酸小檗堿在40.371～215.109pmol/μL濃度范圍內與峰高之間存在線性關系，R2=0.9302，方程y=5.069x-14.172，詳見表1-表5。

結論

20世紀初，國外學者初次提出dsRNA能夠對mRNA產生具有特異性作用的講解作用，能夠特異性抑制相應基因在生物體內的表達，也就是在轉錄后出現基因沉默現象，即RNA干擾，廣泛存在于生物體內，屬于機體排除外源性核酸物質及內源性異常表達物質所表現出的生物自我保護機制，這為臨床研究基因藥物提供具有臨床效果良好的研發思路。隨著對RNA干擾技術的不斷深入研究，以及應用RNA干擾技術研發藥物應用率逐漸提升，該技術有望成為研究基因藥物的重要工具，從而為腫瘤及遺傳性疾病的治療提供強烈助力。小干擾RNA，即siRNA，通常需要與堿基配對后，方可對同源的mRNA進行有效識別，并參與其介導過程。據文獻報道，siRNA在生物體內具有一種結構相似的雙聯RNA，而且siRNA形成過程中，核酸酶Dicer以二聚體形式參與該過程，由于不同生物體內的核酸酶Dicer存在一定的差異，因此形成的siRNA結構也存在一定的差異，由此引發的干擾復合體，即RISC，其把序列作用是反義siRNA，在ATP存在條件下，雙鏈siRNA被解開，即正義鏈與反義鏈互換，而且在RISC活化狀態下靶mRNA序列被切斷。然后新siRNA與同源的新mRNA進行有效識別配對。siRNA相關藥物樣品可在單修飾及完全修飾情況下，在不同條件下進行影響的檢測及研究，有助于從不同方面進一步研究該藥物的功效及藥理作用。本次研究所用的藥物屬于植物體內合成后提取，化學性質比較穩定，為檢測提供良好的物質基礎。

參考文獻

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[2]李紅玲，莫炫永.HPLC法同時測定川黃柏中鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗堿的含量[J].中國藥房，2014，25（27）：2562-2564.

[3]汪超甲.RNA干擾技術原理及其在腦膠質瘤治療中應用[J].國際神經病學神經外科學雜志，2014，41（6）：562-564.

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（作者簡介：劉敏楠，謝菲爾德大學（英國），研究方向為生物工程。）endprint