不同冷凍方法對人睪丸精子冷凍保存效果的研究

王乃輝，柳立軍，薛石龍，侯建文，景原雪，宋德瀟，岳豐，李艷梅，張學紅

(1.蘭州大學第一醫院生殖醫學?？漆t院，蘭州 730000；2.甘肅省生殖醫學與胚胎重點實驗室，蘭州 730000)

無精子癥在男性不育人群中的發生率為10%～15%[1]，對于這部分患者，供精是過去唯一的治療方案。隨著卵胞漿內單精子注射(ICSI)的誕生，作為男性不育治療的睪丸組織活檢技術得以發展[2-3]，包括采用睪丸精子抽吸術、經皮附睪精子抽吸術、睪丸切開活檢取精、顯微睪丸切開取精等方式獲得睪丸精子，從而使無精子癥患者有可能獲得自己的遺傳后代。隨著冷凍技術的不斷發展，睪丸精子冷凍逐漸發展起來，為梗阻性和非梗阻性無精子癥患者帶來了福音[4]。國內外研究者嘗試用多種方法保存睪丸活檢精子或ICSI治療后剩余睪丸精子，但其冷凍復蘇效果尚不十分理想，且冷凍方法及冷凍保護劑的使用也一直存在爭議[5]。如何提高睪丸精子冷凍復蘇率，減少或避免無精子癥患者行二次睪丸穿刺手術，成為了眾多研究者的關注熱點。本研究采用不同冷凍載體和冷凍保護劑對人睪丸組織進行冷凍保存，力求尋找更佳的冷凍方案，提高凍存睪丸精子的復蘇率。

資料和方法

一、研究材料

1.睪丸組織來源：收集2016年2～11月在蘭州大學第一醫院生殖醫學專科醫院行睪丸穿刺的患者(包括門診-診斷性睪丸穿刺及ICSI周期治療)，經知情同意，醫學倫理會批準同意，將剩余的有精子的睪丸組織納入試驗。共獲得46份睪丸組織樣本。

2.主要載體和試劑：1.8 ml冷凍管(Corning，美國)，0.25 ml冷凍麥管(CryoBio System，法國)、超微量冷凍麥管(江蘇泰利達)；甘油(sigma，美國)，Fasrun冷凍保護劑組合(包含冷凍液、解凍液、培養液)(江蘇泰利達)，G-MOPS plus(Vitrolife，瑞典)。

3.主要儀器：IVF工作站(K-systems，丹麥)，倒置顯微鏡(Nikon，日本)

二、研究方法

1.分組：46份睪丸組織樣本，每份樣本平均分成4份，隨機分為A、B、C、D等4組冷凍。A組：1.8 ml冷凍管+甘油復合冷凍劑；B組：1.8 ml冷凍管+Fasrun冷凍劑；C組：0.25 ml麥管+Fasrun冷凍劑；D組：超微量冷凍麥管+Fasrun冷凍劑。

2.睪丸組織冷凍評估：冷凍前后，分別記錄各組前向運動精子數目、非前向運動精子數目、精子復蘇率。

3.睪丸組織冷凍與復蘇：將睪丸組織置于1 ml G-MOPSplus培養液中，機械切碎，觀察并記錄睪丸組織內每200倍視野活動精子數量及正常形態精子數量。將睪丸組織離心，去除上清液后置于 Fasrun 培養液，在32℃、7% CO2培養箱培養30 min。1 500 r/min，離心4 min，去上清，取1/4睪丸組織置于含有 G-MOPS plus的1.8 ml冷凍管中，巴氏吸管加2～3滴甘油，每滴加完后需充分搖勻(編為A組)；其余睪丸組織按1﹕3比例加入 Fasrun 冷凍液。睪丸組織盡量混勻，將3/4睪丸組織平分為3份，分別加入到1.8 ml冷凍管、0.25 ml麥管、超微量冷凍麥管(分別編為B、C、D組)。然后將A、B、C、D組均放置于液氮上方5 cm處熏蒸10 min，投入液氮。睪丸組織液氮中凍存1周復蘇，將A、B、C、D組從液氮中取出，37℃水浴1 min后將睪丸組織轉入Fasrun解凍液，10 min后倒置顯微鏡下觀察并記錄睪丸精子復蘇情況。所有標本的冷凍復蘇操作均由一人完成。

4.觀察指標：冷凍前各組睪丸組織中活動精子(前向運動精子+非前向運動精子)數目/200倍視野；解凍復蘇后，各組睪丸組織中活動精子(前向運動精子+非前向運動精子)數目/(200倍視野)，活動精子數目≥0.25/(200倍視野)的例數、活動精子數目≥0.1/(200倍視野)的例數(以此為易行ICSI例數)；睪丸精子形態。

三、統計學方法

本研究采用SPSS17.0軟件，計數資料的比較采用χ2檢驗進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、各組睪丸精子冷凍復蘇前后的精子活力變化及復蘇率

統計結果顯示，各組睪丸精子冷凍復蘇后與冷凍前相比，精子活力均顯著降低，其中前向運動精子降低更為明顯；D組復蘇率最高，顯著高于A、B兩組(P<0.05)，C組顯著高于A組(P<0.05)；D組略高于C組，差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

二、不同冷凍方法對人睪丸精子的凍存效果影響

冷凍復蘇后，睪丸精子的活力顯著下降，200倍視野能夠觀測到的活動精子數目過少，因此冷凍前記錄數據為活動精子數目≥0.5/(200倍視野)的例數，冷凍后記錄數據為活動精子數目≥0.25/(200倍視野)和≥0.1/(200倍視野)的例數，并以≥0.1/(200倍視野)例數為易行ICSI病例例數。統計結果顯示，D組冷凍復蘇后能夠容易找到正?；顒泳?易行ICSI)的例數顯著高于A組、B組(P<0.05)，C組顯著高于A組(P<0.05)(表2)。

表1 冷凍前后各組間睪丸精子活力及復蘇率比較[(-±s)，%]

注：各組均為46例；與D組相比，*P<0.05；與C組相比，#P<0.05；睪丸精子在200倍視野觀察，由于精子數目稀少，表中精子計數均為10個高倍視野數據

表2 不同冷凍方法對人睪丸精子冷凍保存效果的比較[n(%)]

注：與D組相比，*P<0.05；與C組相比，#P<0.05

討 論

隨著輔助生殖技術的發展，越來越多的無精子癥患者前來就醫，使得睪丸穿刺活檢取精術的數量激增。曾經，診斷性睪丸穿刺術及ICSI后的睪丸組織多被視為醫療廢物而丟棄，患者若要二次進行ICSI周期，還需要再次行睪丸穿刺活檢，極大地增加了患者的痛苦。隨著冷凍技術的發展，睪丸組織冷凍保存成為現實，且有報道稱凍融睪丸組織精子與新鮮睪丸組織精子在ICSI治療時臨床結局無統計學差異[6]。但目前睪丸組織冷凍復蘇的總體效果并不理想[7]，經常需要患者在取卵當天再進行睪丸穿刺活檢取精，加重了患者的身心痛苦及經濟負擔，且反復的睪丸穿刺手術增加了日后睪丸功能下降的風險[8]。對于非梗阻性無精癥者，即使前次手術取精成功，再次手術也有15%～20%的失敗風險[9]。睪丸活檢時凍存精子，以便用于后期ICSI治療，既可以避免反復睪丸穿刺手術給患者帶來的精神、肉體、經濟方面的負擔，又能避免取卵日取精失敗從而導致無法正常受精，方便醫患雙方掌握治療進度。因此，尋求一種更優的睪丸組織冷凍保存方案，提高睪丸精子復蘇率成為我們醫務工作者的一項嚴峻任務。

冷凍保護劑在睪丸精子冷凍復蘇過程中起著重要作用。睪丸精子冷凍中所用冷凍保護劑可分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑，其中常用滲透性保護劑有：1，2-丙二醇、乙二醇、甘油和二甲基亞砜(DMSO)。1，2-丙二醇滲透性強且毒性較DMSO低；乙二醇可快速進入細胞內置換細胞內水分而減少滲透應激；甘油及卵黃廣泛應用于精液和睪丸細胞懸液冷凍，對精子有很好的保護作用；DMSO分子量小，有較強組織穿透性，對睪丸組織等固體組織及細胞懸液能起到較好的保護作用，是目前睪丸組織冷凍最常用的冷凍保護劑[5]。非滲透性保護劑中最常用的是蔗糖，其保護機制目前還不明確。本實驗中，冷凍前和解凍后，睪丸精子都要置于Fasrun冷凍保護劑組合的培養液中培養30 min，孵育睪丸精子，可以明顯提高睪丸精子的活力，以便更快速的篩選出可以用于ICSI的精子。此外，與甘油相比，Fasrun冷凍保護劑中含有的DMSO具有低分子量，高滲透的特性[10]，保證在冰晶形成的過程中，冷凍保護劑濃度增加時仍然能留在溶液中不被析出，從而減少冰晶形成對精子的損傷。在本實驗中，1.8 ml冷凍管+Fasrun冷凍劑組(B組)和1.8 ml冷凍管+甘油復合冷凍劑組(A組)比較，睪丸精子的復蘇率沒有統計學差異(P>0.05)，但前者有優于后者的趨勢。

睪丸精子冷凍另一個重要影響因素：選擇合適的載體[11]。與常規射出精液相比，睪丸組織中精子很少，且還有曲細精管等睪丸組織，應用常規冷凍管回收率低。常用的睪丸組織冷凍載體有冷凍管、超細冷凍管和玻璃化冷凍載體，但對睪丸精子的保存效果還沒有定論[12]。本實驗應用超微量冷凍麥管(D組)，其體積小，降溫速率快，改善了凍融后精子活力，因此睪丸精子復蘇率明顯高于采用了1.8 ml冷凍管的兩組(A、B組)。由于載體體積過小，將睪丸組織放入載體所需時間長，所需載體數量多，增加了冷凍成本，所以超微量冷凍麥管更適用于極少量精子的冷凍。而對于1.8 ml冷凍管，其體積相對較大，所能冷凍的睪丸組織體積大，但由于所需冷凍液多，冷凍過程中冰晶的形成明顯增加睪丸精子的損傷，不適合用于睪丸精子的冷凍。同樣，精子冷凍復蘇后的存活率主要取決于細胞內冰晶形成量，體積小、裝載冷凍保護劑少的載體，能夠增加升溫速率，使溫度能夠快速越過冰晶形成的溫度，從而減少冰晶形成，降低復溫對睪丸精子的損傷。另外，本實驗采用的液氮熏蒸法，在距離液氮相等的高度(5～10 cm)和相同的時間內，液氮吸收的熱量是相同的，載體體積越小，樣本的降溫速率越快。睪丸組織快速越過冰晶形成的溫度區，減少了對精子的損傷。因此隨著載體體積的減小，睪丸精子的復蘇率逐漸升高。

冰晶的形成與冷凍速率有密切關系，而冷凍速率由冷凍保護劑和載體決定[13]。通過選擇適當的冷凍保護劑和冷凍載體可減少細胞內冰晶形成，從而提高精子的存活率。本實驗發現，0.25 ml麥管+Fasrun冷凍保護劑組(C組)，可以得到和超微量冷凍麥管+Fasrun冷凍保護劑組(D組)相近的睪丸精子復蘇率(78.26% vs.86.96%)，但冷凍成本較低且操作過程也較精簡，提高了成本效益[14]。由于冷凍睪丸精子與液氮隔絕，避免了污染的可能，生物安全性高[15]。本實驗由于尚處于實驗階段，數據量還不夠大，且后期ICSI術后的受精率、種植率、妊娠率、流產率等數據還有待完善。

綜上所述，應用改良的超微量冷凍麥管+Fasrun冷凍保護劑可以提高睪丸組織精子冷凍復蘇率，是一種比較理想的冷凍方案；0.25 ml麥管+Fasrun冷凍保護劑的冷凍復蘇效果稍低于超微量冷凍麥管+Fasrun冷凍保護劑組，但其冷凍成本方面優勢明顯，也可作為一種備選方案。

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