棕櫚酸誘導人絨毛滋養層細胞胰島素抵抗模型的建立

管純一，馬旭，夏紅飛

(1. 國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081；2. 北京協和醫學院，北京 100730)

妊娠糖尿病(Gestational diabetes mellitus，GDM)發病率逐年上升，已成為威脅母嬰健康的重要疾病之一[1]。已有文獻報道，患有GDM的孕婦，孕中期羊水中胰島素水平升高，圍生兒易發高胰島素血癥，高濃度胰島素會增加新生兒肥胖和糖尿病的發生幾率[2]。隨著社會發展，我國的飲食結構也發生了巨大變化，肥胖人群日益增加，胎盤作為重要的營養器官，如其暴露在高脂環境發生胰島素抵抗，會造成胎盤內環境中糖類代謝和激素的變化，進而對胎兒生長發育產生影響。但胎盤來源的細胞是否會發生胰島素抵抗尚不十分清楚，因而研究胎盤細胞是否發生胰島素抵抗，對闡明GDM的發生機制及胎兒異常發育的原因十分必要。棕櫚酸是游離脂肪酸中最主要的飽和脂肪酸，能夠誘導肝細胞、骨骼肌和心肌細胞等發生胰島素抵抗[3-5]，被認為是胰島β細胞脂毒性的主要分子，目前廣泛地應用于糖脂毒性研究[6]，故選為構建胰島素抵抗模型的誘導因子。因為胰島素抵抗的臨床研究有極大的局限性，本實驗選用人絨毛滋養層細胞，通過建立穩定的由棕櫚酸誘導的胰島素抵抗模型，為今后GMD的分子機制研究提供了有效的體外細胞研究模型。

材料和方法

一、實驗材料和試劑

1. 人胎盤絨毛滋養層細胞(HTR8-S/Vneo)：由加拿大Graham等人建立，使用RPMI-1640培養基(含10%血清)培養，將培養瓶置于5%CO2、37℃細胞培養箱，待細胞生長至90%左右時，用0.25%的胰蛋白酶消化，1/2傳代繼續培養；1/2種于培養板，待細胞生長至對數生長期進行實驗。

2. 棕櫚酸(Sigma，美國，P5585-25G)0.027 g溶于0.1 N NaOH 1 ml，70℃水浴，配得1 nmol/L母液。

3. 胰島素(Sigma，美國，I4011-50MG)蒸餾水配成10 mmol/L母液，1：100稀釋使用。

4. 蒽酮(Sigma，美國，319899-25G)0.05 g蒽酮溶于25 ml 98%濃硫酸，現用現配。

二、實驗方法

1. 細胞處理和細胞增殖檢測：實驗分為對照組、棕櫚酸組和胰島素組。將HTR8-S/Vneo細胞接種到96孔板，培養24 h，待細胞密度達到孔板面積的80%時，棕櫚酸組加入不同濃度的棕櫚酸處理(0.125、0.25、0.5、0.8、1.0 mmol/L)，胰島素組加入不同濃度的胰島素處理(20、40、60、80、100 nmol/L)，對照組用完全培養基培養。24 h后，用MTT法檢測細胞增殖情況。稀釋5 mg/ml的MTT(sigma，美國，M2128-100MG)母液至0.5 mg/ml，加入96孔板，避光2 h后棄液，加入200 μl二甲基亞砜(Sigma，美國，D2650-100 ml)用酶標儀(Bioteck，美國，Gen5，=562 nm)檢測吸光度(OD)，取3孔的OD平均數值。

2. 細胞葡萄糖攝取量和消耗量檢測：實驗分為對照組、胰島素組、棕櫚酸組和棕櫚酸-胰島素協同處理組。將HTR8-S/Vneo細胞接種至12孔板，培養24 h，待細胞密度達到孔板面積的80%時，棕櫚酸組和棕櫚酸-胰島素協同處理組加入0.125 mmol/L棕櫚酸，培養24 h后，胰島素組加入100 nmol/L胰島素，棕櫚酸-胰島素協同處理組同時加入0.125 mmol/L棕櫚酸和100 nmol/L胰島素，分別培養12、18、24、36 h，用葡萄糖檢測試劑盒(Sigma，美國，GAGO20-1KT)檢測12、18、24、36 h時培養基的葡萄糖濃度。使用酶標儀(Bioteck，美國，Gen5，=540 nm)檢測吸光度(OD)，葡萄糖濃度(mg)=(OD值×0.05)/0.05標準品OD值，重復3次。葡萄糖消耗量=培養基葡萄糖含量-所測葡萄糖濃度。

3. 細胞內總糖量的檢測：收集葡萄糖攝取量實驗中12孔板內細胞，使用蒽酮法檢測細胞內總糖量。用PBS清洗3遍孔板，胰酶消化細胞，800 r/min離心3 min，棄液，加60 μl堿溶液，取30 μl用BCA法檢測蛋白濃度后，沸水浴20 min，冷卻至室溫，每管加入0.5 ml蒽酮，沸水浴5 min，冷卻至室溫后取200 μl加入96孔板，用酶標儀(Bioteck，美國，Gen5，=630 nm)檢測吸光度(OD)，重復3次。根據標準曲線算得數值。

三、統計學處理

采用GraphPad Prism 6軟件進行統計學分析，使用t檢驗和方差分析進行數據處理，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、棕櫚酸對HTR8-S/Vneo細胞活性的影響

通過MTT法檢測發現，棕櫚酸濃度在0.25～1.0 mmol/L時，棕櫚酸組與對照組相比，細胞活性差異有統計學意義(P<0.05)；而棕櫚酸濃度為0.125 mmol/L時，與對照組相比無統計學差異(P>0.05)，證明該濃度下棕櫚酸對細胞活性影響較小，0.125 mmol/L可作為最適棕櫚酸處理濃度(圖1)。

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 不同濃度棕櫚酸對HTR8-S/Vneo細胞的增殖作用

二、胰島素對HTR8-S/Vneo細胞活性的影響

通過MTT法檢測發現，胰島素濃度在0～60 nmol/L時，與對照組相比，細胞活性差異有統計學意義(P<0.05)；而胰島素濃度為100 nmol/L時，與對照組相比無統計學差異(P>0.05)，較為接近對照組，證明該濃度下胰島素對細胞活性影響較小，100 nmol/L可作為最適處理濃度(圖2)。

與對照組比較，*P<0.05圖2 不同濃度胰島素對HTR8-S/Vneo細胞的增殖作用

三、0.125 mmol/L棕櫚酸對HTR8-S/Vneo細胞葡萄糖消耗量的影響

葡萄糖檢測試劑盒(GO)分析細胞培養基中葡萄糖濃度和葡萄糖的消耗量(圖3和圖4)，發現與對照組相比，胰島素處理后，細胞培養基中葡萄糖含量有下降趨勢，葡萄糖的消耗量有增加的趨勢，尤其在12 h和18 h，存在顯著性差異(P<0.01)；棕櫚酸處理對細胞培養基中葡萄糖濃度和葡萄糖的消耗量沒有顯著影響(P>0.05)。胰島素刺激后棕櫚酸處理，與單獨胰島素刺激相比，能在24 h(P<0.001)和36 h(P<0.05)顯著增加細胞培養基中葡萄糖濃度和降低葡萄糖的消耗量。

相互比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖3 不同培養時間HTR8-S/Vneo細胞上清液中葡萄糖含量

相互比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖4 不同培養時間HTR8-S/Vneo細胞葡萄糖的消耗量

四、棕櫚酸對HTR8-S/Vneo細胞總糖量的影響

用蒽酮法檢測細胞內總糖含量發現(圖5)，與對照組相比，胰島素處理18 h(P<0.05)、24 h(P<0.001)和36 h(P<0.01)，細胞內的總糖量顯著增加。不同時間段棕櫚酸組與對照組相比，總糖量沒有顯著性變化。與單獨棕櫚酸組相比，在12 h和18 h時，棕櫚酸-胰島素協同處理組顯著降低細胞內的總糖量(P<0.05)，但在24 h和36 h時，兩者沒有顯著差異。與單獨胰島素組相比，在12 h和18 h時，棕櫚酸-胰島素協同處理組對細胞內的總糖量沒有顯著影響，但在24 h(P<0.01)和36 h(P<0.001)時，棕櫚酸-胰島素協同處理組顯著降低細胞內的總糖量，其結果與葡萄糖消耗量實驗結果基本相一致。

A：標準曲線；B：細胞總糖量測定；相互比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖5 不同處理時間HTR8-S/Vneo細胞總糖量的變化

討 論

胰島素抵抗是指靶器官對正常濃度的胰島素反應不足，表現為外周組織對葡萄糖的攝取和利用障礙，是Ⅱ型糖尿病的發病原因之一[7]。在導致胰島素抵抗發生的假說中，炎癥假說近年來備受關注[8]，其中，由棕櫚酸誘導中產生脂肪因子作為炎癥因子，是否會引起胎盤的胰島素抵抗作用，誘發妊娠糖尿病，是本實驗關注的重點。

近年來，棕櫚酸與胰島素通路之間的作用備受關注。Pardo等[9]發現在肝細胞中，棕櫚酸濃度引發早期激活內質網(ER)與壓力相關的激酶，使凋亡細胞的比例增加，下調IR/IRS1/Akt胰島素通路。Mayer等[10]也提出棕櫚酸調控胰島素活動，棕櫚酸減少會刺激胰島素Akt Ser473磷酸化。棕櫚酸造成胰島素信號通路缺陷[11-12]，而引起胰島素抵抗，在肝細胞和骨骼肌細胞均有文獻報道[13-15]，但在HTR8-S/Vneo細胞中，尚未有棕櫚酸誘導胰島素抵抗模型的報道。本實驗通過構建穩定的棕櫚酸誘導的胰島素抵抗模型，可為胎盤中棕櫚酸與胰島素間的相關功能研究提供便利。

由于棕櫚酸和胰島素長時間處理都會影響細胞活性，為避免由于細胞活性改變導致的葡萄糖消耗量改變，我們分析了棕櫚酸和胰島素處理后細胞活性不變的最佳濃度。我們選取HTR8-S/Vneo為研究對象，用不同濃度的棕櫚酸和胰島素處理細胞，并使用MTT法檢測細胞增殖，判斷細胞活性。發現在棕櫚酸濃度為0.125 mmol/L和胰島素濃度為100 nmol/L時，對細胞毒性最小，基本不影響細胞增值，最接近體內環境，故選做實驗處理濃度。馮沖等[16]實驗選擇胰島素濃度時未對細胞活力進行限定。

本實驗分別使用棕櫚酸和胰島素兩種誘因誘導形成胰島素抵抗模型。胰島素誘導的胰島素抵抗模型，HTR8-S/Vneo細胞對胰島素敏感(P<0.05)，胰島素組葡萄糖消耗量及細胞總糖量相較對照組有顯著差異(P<0.05)，在36 h時仍未出現抑制葡萄糖消耗和糖類生成的促進作用。本研究中，在12 h、18 h時，棕櫚酸組細胞內總糖量顯著低于棕櫚酸-胰島素協同處理組(P<0.05)，到了24 h和36 h，棕櫚酸處理組和棕櫚酸-胰島素協同處理組間顯著差異消失(P>0.05)，且胰島素組的葡萄糖消耗量和細胞總糖量顯著高于棕櫚酸-胰島素協同處理組(P<0.05)。說明該條件下細胞已對胰島素產生耐受，并可維持一段時間。已有文獻報道棕櫚酸影響胰島素信號傳導[17-19]，長時間暴露于棕櫚酸會損害胰島素激活，從而解釋了加入棕櫚酸后，與胰島素處理組相比趨勢明顯緩和，與本實驗結果相一致。

馮沖等[16]檢測發現在HTR8-S/Vneo細胞中48 h形成胰島素抵抗，而本實驗中，經棕櫚酸誘導的HTR8-S/Vneo細胞在24 h已表現出胰島素不敏感，葡萄糖消耗量和總糖量無明顯變化，并在36 h時持續作用。這可能是由于我們使用的處理系統不一樣，馮沖等[16]使用單純胰島素處理細胞，而我們選擇了具有胰島脂毒性的棕櫚酸與胰島素協同處理細胞，由于棕櫚酸的脂毒性作用誘導胰島素通路變化，使胰島素抵抗提前發生[20-21]。我們結果也顯示在36 h單獨胰島素處理未形成胰島素抵抗，與馮沖等[16]的結果一致。這提示了單獨的胰島素處理細胞需要更長的時間產生胰島素抵抗，而棕櫚酸-胰島素協同處理大大縮短了細胞出現胰島素抵抗的時間，這種胰島素抵抗模型更適合用于瞬時轉染外源基因，檢測外源基因對胰島素抵抗的影響。

由此我們得出，棕櫚酸胰島素抵抗模型的建立依賴于反應時間，在0.125 mmol/L棕櫚酸與胰島素協同處理24 h時，誘發HTR8-S/Vneo細胞形成胰島素抵抗，成功建立棕櫚酸誘導的人絨毛滋養層細胞胰島素抵抗模型。

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