柱前衍生反相高效液相色譜法測定山黧豆中的毒素β-ODAP

李改弟

（四川會理鉛鋅股份有限公司，四川 會理615100）

前言

山黧豆，是一種栽培歷史悠久的豆類飼料作物，一年生，盛產于印度、歐洲、非洲及亞洲東部。我國所產山黧豆是從國外引種，分布于甘肅、陜西、新疆等地。山黧豆具有廣泛的適應性，耐寒、耐旱，在干旱年間其它豆類及谷物作物都欠收時，它仍能維持較高的產量，而且山黧豆營養豐富，種子中蛋白含量高達26%～30%，蛋白水解產物含17種主要氨基酸，特別適合我國西北干旱地區種植。但是，有記載稱，過多食用會引起山黧豆中毒：主要癥狀為尿頻，下肢無力，足跟不易抬起，再度發展即可發生下肢癱瘓[1]。山黧豆中含有的一種非蛋白質氨基酸，β-草酰基-L-α，β-二氨基丙酸（β-ODAP）[2]是山黧豆引起中毒的成分，妨礙了山黧豆的推廣和種植。因此研究和建立快速，準確，靈敏度高，選擇性好的分析方法非常重要。

目前，國內外學者已經在β-ODAP的分離鑒定、化學及生物合成、分析方法、毒理學，代謝機理等方面做了大量工作[3]。β-ODAP的分析方法很多，如以前的紙層析法[4]，薄層層析法[5]，鄰苯二甲醛法以及最近的高效液相色譜法等[6]。

參照三七素的測定方法[7]，用預冷研磨獨特的冷凍抽提技術進行樣品的預處理，用乙腈和HAc-Na Ac緩沖溶液作流動相，等度洗脫，目標峰分離度高，峰形好，且使β-ODAP目標峰最先出峰（t=3.62 min），使樣品的分析時間大大縮短，有利于大量樣品的分析。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），Luna-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；電熱恒溫水浴鍋（H H.S21-Ni6），真空干燥箱（D2F-6021），電子天平（FA2204B），冷凍離心機（TGL-20M，高速臺式），全自動新型鼓風干燥箱（ZRD-7080）。

2，4-二硝基氟苯（分析純），乙腈（色譜純），冰醋酸、碳酸氫鈉、無水乙酸鈉、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀，山黧豆。

1.2 色譜條件

色譜柱[Luna-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）]，流動相[乙腈∶HAc-Na Ac緩沖溶液（17∶83）]），柱溫（40℃），檢測波長（360 nm），流速（1.00 mL/min），進樣量為20μL。

Na HCO3溶液（0.5 mol/L），2，4-二硝基氟苯的溶液（FDNB，10.0 mg/mL），標準樣品溶液（1 mg/m L），磷酸鹽緩沖溶液，HAc-Na Ac緩沖溶液。

1.3 樣品處理

稱取山黧豆的種子、根、莖、葉各1 g（精確至0.001 g平行3份），放置于-40℃的冰箱中冷凍保存。取出用在-20℃冰箱中冷凍過的研缽研磨，然后分別加入適量石英砂和7.0 m L乙醇（30%）作為抽提液，研至均勻后靜置3 min。

取其上清液1.0 m L置離心管中于-4℃下冷凍離心15 min。將上述樣品置于65℃恒溫真空干燥28 h，全部烘干。向樣品中加入0.1 m L Na HCO3溶液，震蕩，使其充分溶解。再加入0.1 m L FDNB溶液，在60℃恒溫水浴中進行衍生反應，0.5 h后取出，冷卻至室溫。加入0.8 m L磷酸鹽緩沖溶液（PBS），用0.45μm的有機相濾頭過濾，取其濾液依次進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜圖分析

參考已有學者的研究成果[6]，首先選擇了乙腈和H3PO4-KH2PO4緩沖溶液作為混合流動相，但是實驗條件不穩定，色譜峰峰形差，目標峰分離效果不好，并且流動相在溶劑瓶的濾頭處易結晶，形成堵塞。因此改用乙腈和HAc-Na Ac緩沖溶液作為混合流動相，獲得了較好的峰形且達到基線分離，故實驗采用乙腈和HAc-Na Ac緩沖溶液作為混合流動相。實驗中流動相乙腈∶HAc-Na Ac緩沖溶液配比定為17∶83。

2.2 衍生試劑配比的選擇

在衍生實驗中，FDNB加入量隨分析物的種類和濃度不同而不同，參照已有實驗條件[7]和初步實驗的基礎上，選擇了2，4-二硝基氟苯（FDNB）作為衍生試劑，圖1是衍生試劑FDNB衍生后的色譜圖。實驗發現，衍生配比在1∶1～1∶15時，色譜峰峰面積呈現顯著增大的趨勢；在1∶15～1∶30時，色譜峰峰面積變化不顯著。圖2、圖3、圖4是β-ODAP與FDNB配比分別為1∶12、1∶15、1∶18的色譜圖，從圖2和圖4對比可知，隨著FDNB濃度增大，峰面積有所增加，但都有雜峰。故實驗選擇1∶15的衍生試劑配比。

圖1 衍生劑FDNB的HPLC圖Figure 1 HPLC chromatogram of derivative agent FDNB.

圖2 β-ODAP與FDNB的配比為1∶12的HPLC圖Figure 2 HPLC chromatogram ofβ-ODAP ratio of 1∶12 with FDNB.

圖3 β-ODAP與FDNB的配比為1∶15的HPLC圖Figure 3 HPLC chromatogram ofβ-ODAP ratio of 1∶15 with FDNB.

3 山黧豆樣品的測定

3.1 線性范圍和校準方程

在選定的色譜條件下，β-ODAP色譜峰的峰面積與其濃度在0.007～1.000 mg/m L范圍內呈現良好的線性關系，結果列于表1。校準方程為y=5 164x+167.74，相關系數R2=0.993 9，根據所測結果，繪制校準曲線如圖5所示。

3.2 樣品測定結果

在選定的色譜條件下，對山黧豆的不同部位進行測定，結果列于表2和表3。

圖4 β-ODAP與FDNB的配比為1∶18的HPLC圖Figure 4 HPLC chromatogram ofβ-ODAP ratio of 1∶18 with FDNB.

表1 β-ODAP標準溶液的測定結果Table 1 β-ODAP measurement result of the standard products

圖5 β-ODAP含量與峰面積線性關系Figure 5 The linear relationship of the β-ODAP content and the peak area.

由表3可知，山黧豆不同部位中種子的β-ODAP含量最高。

4 精密度與準確度實驗

取β-ODAP標準樣品（0.70 mg/m L）衍生溶液重復進樣5次，測β-ODAP濃度，計算RSD值，平均回收率（表4）。

表2 山黧豆不同部位中β-ODAP的保留時間和峰面積Table 2 The retention time and peak area ofβ-ODAP in different parts of Lathyrus

表3 山黧豆不同部位中β-ODAP的含量Table 3 The content ofβ-ODAP in different parts of Lathyrus

表4 精密度與準確度實驗Table 4 Results of precision test

由表4可知測定山黧豆中β-ODAP峰面積的相對標準偏差（RSD）為1.6%，即精密度良好。平均回收率為99.0%，即準確度良好。

5 結論

通過實驗可知，采用高效液相色譜法測定β-ODAP具有操作簡單、精密度好、選擇性好，無需其它輔助設備等優點，完全符合氨基酸的分析要求。另外，本法采用2，4-二硝基氟苯（FDNB）作為衍生試劑，保證衍生物有足夠的穩定性，無需快速進樣檢測，尤其是可應用于水相檢測，還可應用于其它氨基酸的檢測和分析中。

[1]覃新程，李志孝，王亞馥.山黧豆及其神經毒素（ODAP）的研究進展[J].生命科學（Chinese Bulletin of Life Sciences），2000，12（2）：52-56.

[2]嚴則義，邢更妹，王崇英，等.家山黧豆及其毒素ODAP的研究[J].西北植物學報（Northwest Journal of Botany），2004，24（5）：911-920.

[3]嚴則義.山黧豆毒素ODAP與草酸的測定方法及其代謝關系的研究[D].蘭州：蘭州大學，2004.16-30.

[4]李志孝，蔡文濤.山黛豆毒素—BOAA紙層析掃描測定[J].蘭州大學學報（自然科學版）[Journal of Lanzhou University（Natural Science Edition）]，1986，22（2）：76-80.

[5]焦成瑾，楊玲娟，雷新有，等.山黧豆毒素的薄層分離[J].氨基酸和生物資源（Amino Acids and Biotic Resources），2007，29（4）：76-80.

[6]張海霞，劉滿倉，靳小舜，等.2，4-二硝基氟苯柱前衍生測定山黧豆毒素β-ODAP[J].分析化學研究簡報（Chinese Journal Anaytical Chemistry），2006，34（1）：100-102.

[7]楊玲娟，高二全，焦成瑾.柱前衍生HPLC法測定三七中的三七素[J].資源開發與市場（Resource Development and Market），2015，31（1）：1-4.