MALDI-TOF MS對河南地區雞源沙門菌快速鑒定的研究

王海花 ， 徐耀輝 ， 苗 麗 ， 陳 靜 , 李文剛

(1.河南牧業經濟學院動物醫學院 ， 河南 鄭州 450046 ；2.河南出入境檢驗檢疫局 ， 河南 鄭州 450003)

雞沙門菌是由多個血清型的沙門菌引起的一類傳染病，雞沙門菌以雞白痢沙門菌和腸炎沙門菌較常見，兩者引起的雞群發病癥狀非常相似，但腸炎沙門菌能夠在禽類及其產品中穩定傳播，其宿主比雞白痢沙門菌更為廣泛，是目前人類食物中毒的主要病原菌之一，這不僅影響養殖業的發展，還威脅人類健康。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)是近年來發展起來的一種新型快速可靠的細菌鑒定方法[1]。操作快速簡便、準確率高等特點，本試驗應用MALDI-TOF-MS對河南地區規模化種雞場致死雞胚和肝臟中分離的41株疑似沙門菌進行鑒定，并用血清學方法進行比較，旨為獸醫臨床沙門菌的鑒定和防治提供一種方法和依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 河南地區規模化種雞場疑似沙門菌致死雞胚，雞肝臟等。

1.2 主要儀器 MALDI Biotyper 高通量微生物鑒定系統，購自德國Bruker Dahonics公司，參數設置：線性操作模式，正離子，基質抑制偏轉模式。脈沖離子提取時間：100 ns。相對分子質量：2 000～20 000 D；VITEK-2全自動細菌鑒定系統，購自法國生物梅里埃中國有限公司。

表1 41株疑似沙門菌血清學、MALDI-TOF-MS和VITEK-2鑒定結果比較

1.3 主要試劑 沙門診斷血清，購自寧波天潤生物藥業有限公司。

1.4 方法

1.4.1 生化鑒定 用比濁儀將所檢測細菌濁度調整到0.5～0.63麥氏濁度范圍內，利用VITEK-2中GN鑒定卡對沙門菌可疑菌株進行檢測。

1.4.2 MOLDI-TOF-MS鑒定 挑取沙門菌顯色培養基上的單個菌落(少量)，直接涂抹到MALDI靶板上，自然干燥后加1μL HCCA 基質液覆蓋樣品，室溫晾干后放入質譜儀進行測量。打開FlexControl軟件，采集數據圖譜，通過Biotyper 軟件進行分析鑒定。結果判斷：使用MALDI Biotyper 3數據庫進行數據比對，標準如下，得分為2.300～3.000完全可靠地鑒定到種的水平；得分為2.000～2.299可靠鑒定到屬的水平，有可能鑒定到種的水平；得分為1.700～1.999有可能鑒定到屬的水平；0.000～1.699，沒有可信的鑒定結果。本研究均選取分值≥2.300的結果作為待測樣本的鑒定結果。

1.4.3 血清學鑒定 按照GB4789.4-2010沙門菌檢驗的操作方法進行血清型的鑒定試驗。

2 結果

2.1 MOLDI-TOF-MS鑒定結果 來源于河南各地種雞場致死雞胚和肝臟分離的41株疑似沙門菌株，經MALDI-TOF-MS鑒定，分別與沙門菌數據庫進行比較，結果表明，41株疑似沙門菌的匹配分值均大于2.300，鑒定結果的可信度很高。

2.2 血清學、MALDI-TOF-MS和VITEK- 2鑒定結果比較 從表1可知,生化(VITEK)鑒定結果是沙門菌，其血清學和MALDI-TOF-MS鑒定結果是沙門菌。血清學鑒定結果是雞白痢或雞傷寒和布利丹沙門菌，MALDI-TOF-MS鑒定結果是腸炎沙門菌。而血清學鑒定是蒙得維的亞沙門菌和賽羅沙門菌，MALDI-TOF-MS鑒定結果是都柏林沙門菌和哈達爾沙門菌，說明血清學鑒定和MALDI-TOF-MS鑒定結果沒有相關性。

3 分析與討論

MALDI-TOF-MS能夠準確快速的檢測細菌體內生物大分子(蛋白質、多肽等)的分子量，它們具有種屬特征，與細菌進化有關，因此可以作為細菌鑒定的重要手段[2]，傳統細菌鑒定方法依據細菌的形態學和生理生化特性分析，不僅操作繁瑣、耗時長，而且由于生化特性容易受培養基、保存時間等因素的影響，常常給鑒定帶來困難。MALDI-TOF-MS具有操作簡單快速、可自動化，結果準確等特點，使其成為細菌鑒定的新選擇。采用MALDI-TOF-MS方法鑒定細菌的報道已有很多[3]，但針對獸醫微生物的研究報道很少。本試驗利用MALDI-TOF-MS對41株沙門菌株進行鑒定，操作方便、快捷快速、省時省力，同時對分離的不同菌株的指紋圖譜進行比較，發現本試驗分離的不同株沙門菌之間存在一定的差異。

本研究采集河南地區規模化種雞場的致死雞胚和雞肝臟，經分離純化后獲得41株沙門菌，分別進行血清學鑒定、生化和MALDI-TOF-MS鑒定，結果表明3種鑒定方法均能鑒定出沙門菌，但對于血清分型結果和MALDI-TOF-MS分型結果沒有相關性，該結論與之前(王曄茹 2008)報道的結果一致[4]。這是由于血清學特異性反應主要針對的是菌體表面的抗原決定簇，而MALDI-TOF-MS鑒定依據的是菌體內所有特異性的蛋白分子的指紋圖譜，兩者的數據差異明顯。

腸炎沙門菌具有垂直傳播的特點,能夠在輸卵管和卵黃里分離到,因此食用未完全加熱至熟的蛋品可以導致人類食物中毒。雖然沙門菌對蛋類食品的污染率相對較小，卻也能引起更大比例的食源性疾病暴發。而在雞場的持續存在，使得養殖的過程中也很容易造成雞群感染發病或雞胚孵化失敗，使雞或雞胚死亡，造成嚴重的經濟損失，因此，有針對性地殺滅某些血清型沙門菌對控制雞及其產品中沙門菌的污染有重要作用。

[1] Jadhav S, Bhave M, Palombo E A. Methods used for the detection and subtyping of Listeria monocytogenes[J]. J Microbiol Methods, 2012,88(3): 327-341.

[2] 胡驍，林肖惠，佟巍，等.沙門菌MALDI-TOF MS 標準菌庫的建立及應用研究[J].衛生研究，2014,43(1)：40-47.

[3] Santos C, Paterson R R, Venancio A,etal.Filamentous fungal characterizations by Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry[J].J Appl Mivrobiol,2010,108:375-385.

[4] 王曄茹，崔生輝， 李鳳琴.基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜在沙門菌檢測和鑒定分型中的應用研究[J].衛生研究，2008，37(6)：685-689.