氣相色譜內標法測定植物油中角鯊烯含量

朱 琳 薛雅琳 劉曉輝 張 東 張東生,3

(國家糧食局科學研究院1，北京 100037) (普洱健源油脂有限公司2，普洱 665000) (江南大學3，無錫 214122)

氣相色譜內標法測定植物油中角鯊烯含量

朱 琳1薛雅琳1劉曉輝2張 東1張東生1,3

(國家糧食局科學研究院1，北京 100037) (普洱健源油脂有限公司2，普洱 665000) (江南大學3，無錫 214122)

通過內標類型和用量的選擇，在已有方法基礎上建立了一種內標法測定植物油中角鯊烯含量的氣相色譜法方法。以角鯊烷為內標，樣品經氫氧化鉀-甲醇皂化，正己烷萃取，采用HP-5毛細管譜柱，程序升溫氣相色譜條件。結果表明，角鯊烯的平均回收率為95.5%～103.0%，精密度為1.42%～5.89%，檢出限為0.05 mg/kg。該方法不僅回收率高，重現性好，而且靈敏度高，該方法可用于測定植物油中角鯊烯含量，為科學評價植物油中營養成分提供技術支撐。

角鯊烯 角鯊烷 內標法 植物油 氣相色譜法

角鯊烯是一種高不飽和的天然萜類化合物，屬于脂質不皂化物，它最初是從鯊魚的肝油中發現的，1914年被命名為Squalene，其化學名為(6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。它屬于開鏈三萜，又稱魚肝油萜，也稱鯊烯，具有提高體內超氧化物歧化酶(SOD)活性、增強機體免疫能力、防癌、防心血管疾病、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能。因此，被廣泛應用于醫藥和化妝品等相關領域[1]。

目前，國際AOAC(Revised 1996)標準中有測定角鯊烯含量的方法[2]，此方法通過不皂化物提取，柱色譜分離，最后采用滴定方法對角鯊烯進行定量，檢測過程較為繁瑣，且最后采用滴定法測量，誤差較大[3]。文獻報道植物油中角鯊烯含量測定的方法較多，主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、氣質聯用法等[4-9]。從采用的定量方式來看，利用高效液相色譜和氣相色譜法多采用外標法定量，很少用到內標法，而氣質聯用法在定量方式主要采用內標法定量。從采用的前理處理方法來看，主要有溶劑稀釋法、SPE柱法和皂化法。溶劑稀釋法直接進樣，不僅會污染色譜柱，縮短色譜柱使用壽命，而且雜質峰較多，影響與目標峰的分離；SPE柱法雖說能去除大部分油脂雜質，但是仍有部分雜質會殘留，殘留下來的雜質出峰時間較長，且使用SPE進行前處理油脂樣品上樣量小，對于角鯊烯含量較低的樣品不適用，從目前的文獻報道中看，也僅有角鯊烯含量較高的橄欖油用SPE進行前處理，該法前處理檢測成本較高不適合推廣使用；由于角鯊烯屬于脂質不皂化物，因此本研究在文獻基礎上選擇不皂物提取經典的方法——液液萃取法作為前處理方法。但不皂化物提取操作比較繁瑣，難免會有所損失，而內標定量方法會減少操作上的誤差，提高方法的準確性。因此，本研究通過內標種類和用量的選擇，選出一種適用于氣相色譜法定量角鯊烯的內標物質角鯊烷，建立一種以角鯊烷為內標測定植物油中的角鯊烯含量的氣相色譜法，該法不僅分離效果好、靈敏度高、回收率高且成本低，適合植物油中角鯊烯含量測定方法推廣使用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生油、油茶籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、特級初榨橄欖油、大豆油8種植物油：市售。

氫氧化鉀、乙醇、無水硫酸鈉均為分析純；正己烷為色譜純；角鯊烯標準品(≥98%)、5α-膽甾烷標準品：美國sigma公司；角鯊烷標準品(≥98%)：東京化成工業株式會社；二十四烷標準品、正三十二烷標準品：北京百靈威科技有限公司。

7890A氣相色譜儀(FID檢測器)：安捷倫(Agilent)公司；旋轉蒸發儀：瑞士步琪(Buchi)公司；氮吹儀：美國Organomation公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準品的配制

準確稱取25 mg角鯊烯、25 mg角鯊烷標準品分別用正己烷定容于25 mL容量瓶，即配制成1 mg/mL角鯊烯標準儲備液和1 mg/mL內標角鯊烷標準溶液。

1.2.2 樣品前處理

準確移取300 μL角鯊烷內標溶液于250 mL磨口燒瓶中，在氮吹儀上吹干后，準確稱取0.2～2 g樣品于此燒瓶中，其余步驟同文獻[9]。

1.2.3 色譜條件

氣相色譜柱：HP-5毛細管柱，長30 m，內徑0.32 mm，薄膜厚度0.25 μm；載氣：高純氮氣(純度99.999% )，恒壓：16 psi，分流比1∶10；進樣口溫度：250 ℃；柱溫采用程序升溫方式，以15 ℃/min的速率從160 ℃升溫到220℃，保持2 min，然后以5 ℃/min的速率升溫到280 ℃，保持20 min；最后以5 ℃/min的速率升溫到300 ℃，保持2 min；FID檢測器：溫度300 ℃，氫氣流速40 mL/min，空氣流速450 mL/min，尾吹氣流速30 mL/min；進樣量：1.0 μL。

2 結果與分析

2.1 內標物質的選擇

采用內標法定量時，內標物的選擇是一項十分重要的工作。內標物選擇的原則為內標物應當是試樣中不存在的純物質，這樣內標物能準確加到樣品中去；內標物應當和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學性質(如化學結構、極性、揮發度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應特征，最好與被分析物質為同系物；同時，在色譜分析條件下，內標物必須能與樣品中各組分充分分離。根據以上特點，本研究從二十四烷、角鯊烷、5α-膽甾烷、正三十二烷中篩選作為植物油中角鯊烯含量測定的內標，按1.2.3色譜條件進行分析，這幾種內標出峰時間分別為二十四烷9.4 min，角鯊烷12.9 min，5α-膽甾烷 19.4 min，三十二烷 20.6 min。通過8種植物油(花生油、油茶籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、特級初榨橄欖油、大豆油)進行測定，只有角鯊烷能與樣品中各組分完全分離，且各植物油本底不含內標角鯊烷，同時，角鯊烷與角鯊烯結構相似，出峰位置較為接近且可完全分離，滿足方法學中對內標的要求，因此，選用角鯊烷作為角鯊烯氣相色譜法測定的內標物質。

2.2 內標加入量的選擇

經查閱文獻，內標加入量建議在待測物質的濃度曲線的1/6～1/3處[10]。1～160 μg/mL角鯊烯與峰面積的標準曲線見圖1，內標角鯊烷加入質量濃度范圍應為27～53 μg/mL。因此，加入終質量濃度為30 μg/mL內標溶液可以滿足定量要求。

圖1 角鯊烷內標加入量范圍

2.3 樣品稱樣量的確認

根據本方法樣品最終定容至10 mL正己烷中，則對于角鯊烯含量≤800 mg/kg的植物油，加入終質量濃度為30 μg/mL角鯊烷內標，待測角鯊烯質量濃度最高為160 μg/mL，則推薦稱樣量為2 g可滿足定量要求范圍。

經查閱文獻可知，在植物油中橄欖油的角鯊烯含量較高，最高可達7 000～8 000 mg/kg，對于角鯊烯>800 mg/kg的植物油，加入終質量濃度為30 μg/mL角鯊烷內標，待測角鯊烯質量濃度最高為160 μg/mL，則推薦稱樣量為0.2 g可滿足定量要求范圍。因此，根據樣品角鯊烯含量不同，稱量樣品進行測定。

2.4 方法學評價

2.4.1 校正因子

配制30 μg/mL角鯊烷內標的角鯊烯工作液：將1 mg/mL角鯊烯標準儲備液用正己烷稀釋至質量濃度分別為2.5、5、10、20、50、100、200、300、400 μg/mL的標準工作液，并保證每個工作液中加入終質量濃度為30 μg/mL的角鯊烷的內標。角鯊烯與角鯊烷峰面積比為橫坐標(X)，以角鯊烯與角鯊烷質量比為縱坐標(Y)，得到內標校正曲線為Y=1.010 7X，R2=0.999 8(n=4)，角鯊烯在質量濃度范圍2.5～400 μg/mL與內標角鯊烷質量濃度30 μg/mL呈良好線性關系且定量范圍較寬，該校正曲線的斜率1.010 7即為角鯊烯和角鯊烷的校正因子，因此，在給定的條件下，用氫火焰離子化(FID)檢測器檢測等量的角鯊烯和角鯊烷時可獲得相同的響應值，即角鯊烯和角鯊烷的校正因子為1.0。所以在進行檢測時可不用配制角鯊烯與角鯊烷的內標校準曲線，直接用加入樣品中的內標量進行定量。

2.4.2 方法回收率和精密度

在已知角鯊烯含量的大豆油中分別加入不同濃度的角鯊烯標準品，低溫避光振蕩72 h，使角鯊烯標準品在大豆油中充分平衡，按建立的檢測方法進行皂化、提取和檢測，計算角鯊烯在201.18～8 002.13 mg/kg添加水平的回收率(同一水平樣品組n=6)和精密度(RSD)。4個添加水平結果見表1所示，不同水平角鯊烯的回收率為95.5%～103.0%，相對標準偏差為1.42%～5.89%。角鯊烯和角鯊烷混合標準溶液色譜圖見圖2，加標前后樣品色譜圖見圖3和圖4。

圖2 角鯊烯和角鯊烷混合標準溶液氣相色譜圖

圖3 加標前樣品氣相色譜圖

圖4 加標后樣品氣相色譜圖

表1 角鯊烯回收率和精密度試驗結果(n=6)

2.4.3 方法檢出限

以S/N≥3確定方法的檢出限，該方法角鯊烯的檢出限為0.05 mg/kg。

2.5 實際樣品測定

分別取花生油、油茶籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、特級初榨橄欖油對其內角鯊烯含量按方法1.2.3進行測定，結果見表2。由表2可知，橄欖油中角鯊烯最高為5 770.40 mg/kg，其他油中的角鯊烯含量較低，含量最低的為芝麻油，僅含14.74 mg/kg。

表2 7種食用植物油中角鯊烯的含量

3 結論

目前，利用液液萃取法提取植物油中角鯊烯的方法主要利用外標法定量，但是由于液液萃取前處理方法操作較為繁瑣，難免會有所損失。本研究通過8種植物油(花生油、油茶籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、特級初榨橄欖油、大豆油)，4種內標物質(二十四烷、角鯊烷、5α-膽甾烷、正三十二烷)進行篩選，選出一種適合氣相色譜法定量植物油中角鯊烯的內標物質角鯊烷，只有角鯊烷能與樣品中各組分完全分離，且各植物油本底不含內標角鯊烷，同時，對角鯊烷內標加入量進行選擇，建立一種以角鯊烷為內標定量角鯊烯的氣相色譜法，該方法加標回收率為95.5%～103.0%，精密度為1.42%～5.89%，檢出限為0.05 mg/kg，由此可以看出，該方法不僅回收率高，重現性好，而且靈敏度高，該方法的建立不僅為植物油中角鯊烯的測定提供檢測參考，同時為下一步科學評價植物油營養成分提供技術支撐。

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Determination of Squalene in Vegetable Oils by Gas Chromatography with an Internal Standard

Zhu Lin1Xue Yalin1Liu Xiaohui2Zhang Dong1Zhang Dongsheng1,3
(Science Academy of State Grain Administration1，Beijing 100037) (Pu’er Jianyuan Oil Co.，Ltd.2，Pu’er 66500) (Jiangnan University3，Wuxi 214122)

An analytical method based on the previous studies was developed for the determination of squalene in vegetable oils using internal standard by gas chromatography. Squalane was chosen as internal standard. The samples were saponified with potassium hydroxide-ethanol solution, then extracted byn-hexane, and analyzed by gas chromatography. Column HP-5 was used in the study. The results indicated that the average recovery rate of squalene was 95.5%～103.0% with relative standard deviations of 1.42%～5.89%. The limit of detection for squalene was 0.05 mg/kg. The method could be used for determination of squalene in vegetable oil with high recovery, good reproducibility and high sensitivity. It was suitable for the determination of squalene in vegetable oils, and also provided technical support for the scientific evaluation of nutritional components in vegetable oils.

squalene, squalene, internal standard method, vegetable oil, gas chromatography

TS 225.1

A

1003-0174(2017)12-0117-04

“十三五”國家重點研發計劃(2016YFD040 1403-3)

2016-12-26

朱琳，女，1984年出生，助理研究員，生物工程

薛雅琳，女，1960年出生，教授級高級工程師，糧油品質及標準研究