乙醇對谷朊粉酶解產物的苦味影響研究

彭 晶 郭曉娜 朱科學

(江南大學食品學院；江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，無錫 214122)

乙醇對谷朊粉酶解產物的苦味影響研究

彭 晶 郭曉娜 朱科學

(江南大學食品學院；江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，無錫 214122)

為了探尋降低谷朊粉酶解產物苦味的方法，通過添加不同濃度的乙醇(5%、10%和15%)，研究其對堿性蛋白酶酶解產物苦味值、游離氨基酸和相對分子質量分布的影響，以及在乙醇存在下堿性蛋白酶、中性蛋白酶以及風味蛋白酶3種復配酶解體系所制得的酶解產物的苦味值和相對分子質量分布變化。結果表明：加入乙醇后，在相同的水解度下(DH)，堿性蛋白酶的酶解產物苦味值降低，并與加入乙醇的濃度呈負相關。添加乙醇后，相對分子質量小于1 000的組分含量顯著(P<0.05)降低，游離疏水性氨基酸(Pro，Ile，Phe和Met)顯著(P<0.05)增加。添加乙醇后，3種復配酶解體系酶解產物苦味降低，相對分子質量小于1 000的組分含量顯著(P<0.05)降低。與添加堿性蛋白酶單一酶解相比，在相同的水解度下3種酶復配酶解產物的苦味值進一步降低。添加低濃度乙醇對3種酶的活性影響較小。

乙醇 堿性蛋白酶 中性蛋白酶 風味蛋白酶 苦味肽

谷朊粉即面筋蛋白，是小麥淀粉生產過程中的副產物。谷朊粉中蛋白質質量分數在70%～80%，是優質的植物蛋白[1]。但隨著小麥淀粉產量的增加，谷朊粉的產量也急劇增加，導致谷朊粉供大于求。此外，谷朊粉的溶解度低，功能性質差，也極大地限制了谷朊粉在食品工業中的應用[2]。

利用蛋白酶酶解谷朊粉，不僅能夠改善谷朊粉的溶解性，而且還能夠產生一些具有生物活性的小分子肽[3-4]，具有極高的經濟價值。谷朊粉中含有人體所需氨基酸15種，尤其是谷氨酰胺含量超過30%[5]，谷氨酰胺肽在醫藥食品有著較好的應用前景。因此，酶解谷朊粉制備具有生物活性肽產品具有天然的優勢。然而，在酶解過程中，疏水性氨基酸不斷地暴露出來，酶解產物的苦味值增加[6]。苦味的出現極大的限制了酶解產物的應用。有關酶解產物脫苦的研究主要集中在以下幾個方面[7]：1)應用活性炭吸附苦味肽；2)使用不同的內切酶和外切酶，切除端位疏水性氨基酸；3)加入添加劑掩蓋苦味。使用活性炭處理酶解樣品，苦味肽吸附在活性炭中并脫除，降低酶解產物的苦味值[8]。但在苦味肽脫除過程中，酶解產物的氮得率也會降低，成本增加。選用外肽酶切除苦味肽末端氨基酸[9-10]，能得到苦味值較低的酶解產物。但氨肽酶和羧肽酶專一性相對較高，增加酶解成本，因此并不適合工業化大規模生產。環糊精為常用的苦味掩蓋劑，利用其疏水性空腔包裹苦味肽，能夠掩蓋酶解產物的苦味。掩蓋劑一般添加量較大，既會造成成本增加[11]，同時也會降低單位質量中活性肽的百分含量。因此，亟需簡單高效的方法生產低苦味活性肽。

大多數酶解過程都是在水相中進行，而有機試劑存在下對于酶解產物苦味值影響的研究較少。根據前期的調研與試驗已證實，乙醇溶液對制備低苦味酶解產物有著積極作用。本試驗研究乙醇的添加，對堿性蛋白酶酶解產物苦味值的影響，酶解產物中肽分子質量變化以及低水解度下游離氨基酸的釋放規律。堿性蛋白酶的較高酶解效率，被食品工業青睞。但由于酶解產物苦味值較重，并不適合單一使用酶解生產。因此，本試驗通過堿性蛋白酶，中性蛋白酶和風味蛋白酶的復配，探究了在不同乙醇濃度下的苦味值和相對分子質量變化。最后測定了在不同乙醇濃度下，3種蛋白酶的活性變化，以期為工業化酶解谷朊粉制備低苦味肽粉提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷朊粉：安徽瑞福祥公司，蛋白質質量分數78.08%；堿性蛋白酶，中性蛋白酶和風味蛋白酶：諾維信酶制劑公司，為液體，酶活分別為1.26×103U/mL、3.40×103U/mL和2.30×103U/mL；牛血清蛋白、無水乙醇、奎寧：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

EL204-IC電子天平、FE20實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；Agilentl100 氨基酸分析儀：Agilent(美國)公司；冷凍干燥機：LABCONCO (美國)公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 堿性蛋白酶酶解試驗

稱取10.00 g的谷朊粉，分別加入100 mL去離子水以及100 mL 的5%、10%、15%(V/V)的乙醇溶液調制成5%(m/V)谷朊粉懸浮液。在50 ℃恒溫水浴下，加入1 mol/L的NaOH溶液，保持體系pH=8.0穩定不變。加入1%(底物蛋白質含量)的堿性蛋白酶。酶解達到相同的水解度時，100 mL樣品置于沸水浴中，加熱10 min滅酶，冷卻后，冷凍干燥。

1.3.2 堿性、中性和風味蛋白酶復配試驗

稱取10.00 g的谷朊粉，分別加入100 mL去離子水以及100 mL的5%、10%、15%(V/V)的乙醇溶液調配成5%(m/V)的懸浮液。在50 ℃恒溫水浴下，依次加入堿性蛋白酶，中性蛋白酶和風味蛋白酶反應8 h。3種蛋白酶加入比例為2∶2∶1，總量為1%(底物蛋白質含量)，加入的時間依次為0、2、6 h。反應過程中，加入1 mol/L的NaOH溶液保持體系pH穩定，分別為堿性蛋白酶pH=8.0，中性蛋白酶和風味蛋白酶pH=7.0。酶解1h后，100 mL樣品置于沸水浴中，并放置于沸水浴中，加熱10 min滅酶，冷卻后，冷凍干燥。

1.3.3 水解度的測定

水解度是指反應體系中斷裂的肽鍵占原總肽鍵的比例。當水解度越高時，斷裂的肽鍵數越多，得到的肽分子質量就越小。本試驗采用pH-stat[12]法測定酶解過程中的水解度，其公式為：

式中：DH為水解度/%；B為反應過程中消耗堿液體積/mL;Nb為堿液濃度/mol/L; α為氨基解離度，對于堿性蛋白酶1/α=1.13，中性蛋白酶和風味蛋白酶1/α=2；Mp為酶解底物中蛋白質含量；htot為每克蛋白質中肽鍵的毫摩爾數，對于小麥面筋蛋白htot=8.38。

1.3.4 苦味的評價方法

酶解產物苦味值的測定方法參考Fu等[13]的方法，并作部分修改。將冷凍干燥的酶解樣品溶解于去離子水中，配制成2%的待測液。感官評定小組由10人組成，取溶解樣品2～3 mL于口中，10 s后吐出。以奎寧溶液為標準物，分別以1.0×10-4、5.0×10-5、2.5×10-5、1.0×10-5、5.0×10-6g/mL代表苦味值10、5、2.5、1、0.5分。感官評定的平均值即為此樣品的苦味值。

1.3.5 相對分子質量分布測定

相對分子質量分布的測定采用QB/T 2653-2004[14]中的高效液相排阻色譜法。HPLC 系統為 Waters 600，色譜柱為 TSKgel 2000 SWXL(7.8 mm×300 mm)，流動相為乙腈/水/三氟乙酸(45/55/0.1)，流速為0.5 mL/min，柱溫 30 ℃，檢測波長220 nm。稱取2.0 mg干燥的樣品，加入1 mL的流動相并漩渦震蕩10 min，透過0.22 μm的有機濾膜后取10 μL上柱。分別采用標準品桿菌酶、細胞色素、抑肽酶、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸和乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸進行相對分子質量的校正。根據所得的相對分子質量與保留時間之間的回歸方程測定酶解產物的相對分子質量。

1.3.6 酶解產物游離氨基酸測定

游離氨基酸含量測定參考Fekkes等[15]方法。酶解樣品冷凍干燥后用，精確稱取1.000 g左右樣品，用5%三氯乙酸分散沉淀后過濾離心，取上清液。采用鄰苯二甲醛OPA柱前自動衍生，Agilent 1100 液相色譜儀進行氨基酸組成分析。流動相由0.02 mol/L的醋酸鈉和體積比為1∶2的甲醇-乙腈溶液組成，柱溫40℃，流速1.0 mL/min，檢測波長為338 nm。氨基酸組成定性以色譜峰的保留時間判斷，氨基酸組成含量以峰面積外標法進行計算。

1.3.7 水溶性蛋白含量的測定

酶解產物中的水溶性蛋白質含量測定采用福林酚法，具體操作參考賈維寶等[16]方法。稱取1～2 mg的凍干樣品，溶解于1 mL的去離子水中，漩渦震蕩10 min后，7 690 g 離心10 min。取上清液加入福林酚試劑，于750 nm處測量吸光度值，從標準曲線中得出酶解產物中水溶性蛋白質含量。

1.3.8 酶活性的測定

酶活性的測定具體步驟采用GB 25594—2010[17]中的方法，并作部分修改。配置乙醇濃度分別為0%、5%、10%和15%的0.015 mol/L，pH=8.0的磷酸鹽緩沖液。稱取適量的酪蛋白，配置成1%(m/V)的酪蛋白磷酸鹽溶液。移取2 mL酪蛋白溶液，加入10 μL的酶試劑，在37 ℃恒溫水浴反應5 min。待反應結束后，加入2.0 mL的10%三氯乙酸溶液，7 690 g離心15 min。1單位酶活即為在37 ℃下1 min內催化酪蛋白產生酪氨酸的量。

1.4 數據統計與分析

本試驗采用Excel 2010 軟件處理數據(平均值±標準偏差)，利用 IBM SPSS Statistics 16.0統計分析軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結果與分析

2.1 乙醇對堿性蛋白酶酶解產物苦味值的影響

圖1為不同濃度乙醇添加量，相同水解度的堿性蛋白酶酶解產物苦味值。隨著酶解過程的進行，苦味值都呈現出先增高后降低的趨勢。在酶解初期，疏水性氨基酸暴露，苦味肽產生，酶解產物的苦味值增加；隨著酶解程度增大，肽被水解成游離的氨基酸，游離氨基酸較其組成短肽的苦味值低[6]，從而酶解產物苦味值降低。

加入乙醇后，相同水解度下的酶解產物苦味值降低，酶解產物的苦味值與乙醇濃度呈負相關。Tchorbanov等[18]的研究中表明，乙醇的添加增加了酶與某些肽段結合的困難，降低了酶解這些肽段的幾率。添加乙醇后，酶解產物的苦味值降低，苦味肽含量降低。相同的酶解條件下，同一水解度則表明酶解體系中斷裂的肽鍵總數相同。乙醇添加后苦味值的降低，有可能是因為乙醇存在下，酶解體系中產生的肽段發生改變，無法生成一些能夠產生苦味的肽段。

圖1 乙醇對堿性蛋白酶酶解產物苦味值影響

2.2 乙醇對堿性蛋白酶酶解產物相對分子質量分布的影響

表1表明，隨著水解度的增高，酶解產物中低分子質量組分含量不斷地增加。相同水解度下，加入乙醇組，低分子質量(<1 000)組分所占得比例顯著降低(P<0.05)，與乙醇濃度負相關。

表1 不同濃度乙醇對堿性蛋白酶酶解產物分子質量影響

注：數據均為平均值±標準偏差；同列中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)；n=3，表3～表5同。

酶解產物產生苦味的原因主要是由于產生苦味肽。肽來源相同的情況下，肽的苦味值隨著肽相對分子質量的降低而增加[6]。在Guigoz等[19]的研究中，分離出200多種苦味肽，其中大部分的苦味肽是由2～15個氨基酸組成，這些苦味肽的相對分子質量大多數都小于1 000。5%和10%水解度下，酶解產物中肽含量較多，加入乙醇后低分子質量組分含量降低，苦味值降低，可能是添加乙醇，限制了某些苦味肽的產生。15%水解度下，酶解產物中低相對分子質量比例增加，多肽被水解為游離氨基酸，游離的氨基酸比其組成的多肽苦味值低。添加乙醇組的酶解產物中低相對分子質量含量比空白組低，可能是因為乙醇的存在下，一些非苦味的肽段并不能夠被蛋白酶繼續酶解。

2.3 乙醇對5%DH下酶解產物中游離氨基酸含量的影響

單一使用堿性蛋白酶過程中，為保持體系pH的穩定，加入了較多的堿液導致酶解產物的鹽分含量較高，降低了酶解產物的風味，增加了后續脫鹽成本。堿性蛋白酶的酶切位點主要在肽羧基側具有芳香或疏水性氨基酸[6]，酶解產物苦味值較大，因此選擇3種酶復配降低酶解產物的苦味值。在3種酶復配體系中，堿性蛋白酶加入量少，酶解時間短，對整個酶解的水解度貢獻度并不高。本試驗研究了在5%水解度下，不同乙醇的添加對堿性蛋白酶酶解產物中游離氨基酸釋放量的影響。表2表明，在5%的水解度下，加入乙醇后疏水性氨基酸如Pro，Ile，Phe和Met含量都有顯著性增加(P<0.05)，并隨著乙醇濃度的增加，疏水性氨基酸的釋放增多。疏水性氨基酸影響酶解產物的苦味主要在兩個方面[6]：1. 位于肽兩端的疏水性氨基酸種類；2. 肽段中疏水性氨基酸的含量。Ishibashi等[20]研究含有Pro的肽段時發現，當Pro位于肽兩端時，肽呈現出較強的苦味值。當疏水性氨基酸位于肽的C-端或N-端時，肽呈現苦味的可能性增加。乙醇添加后，酶解產物中疏水性氨基酸釋放量增加，疏水氨基酸位于肽端的幾率降低，酶解產物的苦味值也隨之降低。

表2 不同濃度的乙醇對5%水解度下堿性蛋白酶水解產物中游離氨基酸的影響

注：數據均為平均值±標準偏差；同行中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)；n=3。

2.4 乙醇對3種酶復配酶水解度產物的影響

圖2 乙醇對3種酶復配酶解產物的水解度影響

水解度的大小可以用來表征酶解反應程度。圖2所示為空白以及在乙醇添加量5%、10%、15%下，3種酶復配時水解度變化。從圖2可以看出，隨著酶解時間的延長，空白組和對照組的水解度都有著不同程度的增加。酶解起始階段，水解度快速增加，隨著酶解過程的進行，水解度增加趨于平緩。

加入不同濃度的乙醇后，對于酶解產物的水解度都有著不同的影響。其中，5%的乙醇添加量影響較小，10%和15%的乙醇添加量影響較大。水解度可從側面表征酶解產物中肽段的大小。加入乙醇對水解度的影響，可能是由于在高濃度乙醇(10%和15%)添加量下，存在一些肽段，蛋白酶與之接觸變難，即使有充分的酶解時間，也不能夠被酶解[21]。

2.5 乙醇對3種酶復配酶解產物苦味值的影響

圖3所示為在相同酶解時間下，添加不同濃度的乙醇，對3種酶復配酶解產物苦味值的影響。隨著堿性蛋白酶和中性蛋白酶的加入，酶解產物的苦味值呈現出增高的趨勢，而加入風味蛋白酶后酶解產物的苦味值有所降低。這是由于風味蛋白酶是外切酶，主要作用于肽端的氨基酸，切除肽端疏水性氨基酸后，酶解產物苦味值則會降低[22]。由圖1～圖3可知，與單一使用堿性蛋白酶相比，在相同的水解度下，復配酶解產物的苦味值更低。3種酶復配中，在相同的酶解時間下，加入乙醇后酶解產物的苦味值降低。并隨著乙醇濃度的增加，苦味值進一步降低。加入乙醇后，不僅對單一堿性蛋白酶的酶解產物苦味值有降低作用，并且對3種復配酶體系的酶解產物苦味值的降低也有著一定的作用。

圖3 乙醇對3種酶復配酶解產物苦味值的影響

2.6 乙醇對3種酶復配酶解產物相對分子質量的影響

表3為在同一水解時間下，不同乙醇添加濃度對酶解產物分子質量分布影響。乙醇對3種酶復配體系的酶解產物相對分子質量影響與單一堿性蛋白酶水解的趨勢一致，即相對分子質量小于1 000酶解產物含量降低，并隨著乙醇濃度的增加，低分子質量組分含量呈現降低趨勢。

表3 不同濃度的乙醇對3種酶復配酶解產物相對分子質量分布影響

2.7 不同酶解條件下，酶解產物中水溶性蛋白含量變化

表4和表5分別為堿性蛋白酶和3種酶復配下，酶解產物中水溶性蛋白質含量的變化。在同一水解度下，乙醇對于堿性蛋白酶酶解產物水溶性蛋白質含量的影響較小。對于3種酶復配，在同一酶解時間下，加入5%的乙醇對與水溶性蛋白質含量影響較小，加入10%和15%乙醇影響較大，并隨著乙醇濃度的增加含量降低。

表4 堿性蛋白酶酶解產物水溶性蛋白含量

表5 3種酶復配酶解產物水溶性蛋白含量

2.8 乙醇對3種酶活性的影響

圖4為3種酶在不同乙醇濃度下的酶活。在加入乙醇后，3種酶的活性都有不同程度的降低。其中堿性蛋白酶在5%和10%乙醇濃度下，酶活性降低并不明顯。在高濃度乙醇(15%)中，酶活性明顯降低。中性蛋白酶在高濃度乙醇的存在下，酶活性降低速度快。乙醇對于風味蛋白酶的影響較小。有機試劑對酶蛋白作用，主要是由于蛋白質構象中的“柔性”隨著水分含量的減少而下降，導致酶對外界干擾的抵抗力降低[23]。不同種類酶的蛋白質構象不同，因此不同種類酶在有機試劑中酶活性也不同。在實際應用中，需要考慮酶解效率問題，而低濃度的乙醇(5%)對3種蛋白酶的酶活性影響較小，酶解產物的苦味值也有所降低，因此更適合工業化生產。

圖4 乙醇對3種酶的酶活影響

3 結論

以谷朊粉作為底物，研究添加5%、10%和15%不同濃度的乙醇對堿性蛋白酶酶解產物苦味值的影響。隨著乙醇濃度的增加，酶解產物的苦味值降低，相對分子質量小于1 000的組分含量顯著降低(P<0.05)。在5%的水解度下，疏水性氨基酸(Pro，Ile，Phe和Met)釋放量顯著(P<0.05)增加。添加低濃度(5%)乙醇，對于堿性蛋白酶，中性蛋白酶和風味蛋白酶復合酶酶解程度的影響較小，添加高濃度的乙醇(10%和15%)，對酶解程度的影響較大。乙醇加入后，產生苦味的低分子質量組分含量顯著降低，并隨著乙醇添加量的增加而降低。在低濃度乙醇(5%)添加量下，對于堿性蛋白酶和風味蛋白酶的酶活性影響較小，更適合工業化生產低苦味活性肽。

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Effects of Ethanol on Debittering of Wheat Gluten Hydrolysates

Peng Jing Guo Xiaona Zhu Kexue
(School of Food Science and Technology, Collaborative Innovation Center for Food Safety and Quality Control, Jiangnan University, Wuxi 214122)

To explore the way to reduce the bitter of wheat gluten hydrolysates, different concentration of ethanol (5%, 10% and 15%) were added during hydrolysis process. The changes of free amino acid, molecular weight distribution and bitterness value of hydrolysates produced by Alcalase were studied. Furthermore, the changes of molecular weight distribution and bitterness value of hydrolysates produced by the combination of Alcalase, neutral protease and flavourzyme were also measured. The results showed that at the same degree of hydrolysis (DH), hydrolysates produced by Alcalase had less bitterness after adding ethanol. The bitterness value had negative correlation with the ethanol concentration. The content of protein (MW<1 000) and free hydrophobic amino acids (Pro, Ile, Phe and Met) were increased (P<0.05) in ethanol groups.Hydrolysates produced by combination of three kinds of enzymes showed less bitterness value and the content of protein (MW<1 000) significant (P<0.05) increased in ethanol groups. The bitterness of hydrolysates produced by the combination of enzymes showed less value than Alcalase at the same DH. Low concentration of ethanol had less effect on the enzyme activity.

ethanol, alcalase, neutral protease, flavourzyme, bitter peptides

TS213.2

A

1003-0174(2017)12-0056-07

國家高技術研究發展計劃(2013AA102201)，江蘇省重點研發計劃項目(BE2015327)

2016-11-23

彭晶，男，1990年出生，碩士，食品科學與工程

朱科學，男，1978年出生，教授，博士生導師，小麥精深加工

《中國油脂》(月刊)

國內郵發代號52-129國外發行代號M5889

追蹤學科發展動態 報道行業最新成果

關注油脂發展熱點 共謀油脂創新未

主要欄目：油脂加工/油料蛋白/油脂化學/油脂儲藏/油脂營養/新油源/特種油脂/油脂化工/生物柴油/綜合利用/實用技術/檢測分析/標準規范/食品安全/節能減排/環境保護/縱橫信息/特色專欄/產品廣告等。

發行對象：從事油脂及相關行業規劃、決策、咨詢、研究、開發、生產、檢測、工程服務、項目管理、工廠管理、設備運行、維修等組織和個人。

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