一株球形芽孢桿菌生產菌株的培養基優化研究

劉芳+廖先清+張志剛+周榮華+饒犇+張遵霞

摘要：利用單因素篩選和正交試驗，對球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）NBIM-311高毒菌株的發酵培養基進行優化，得到其最佳培養基配方為魚粉20.0 g/L，玉米漿15.0 g/L，花生粕60.0 g/L，酵母膏7.5 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀0.1 g/L。通過200 L和5 000 L發酵罐分別發酵，發酵液對致倦庫蚊致死中濃度分別為0.963 mg/L和0.852 mg/L；發酵液經過后處理所制備的原粉對致倦庫蚊致死中濃度分別為0.018 9 mg/L和0.022 3 mg/L。

關鍵詞：球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）；致倦庫蚊；培養基；優化

中圖分類號：Q939.124 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）23-4516-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.024

Abstract： The fermentation medium for highly toxic Bacillus sphaericus strain NBIM-311 against Culex quinquefasciatus was optimized through single factor screening and orthogonal experiments. The optimum medium was composed of 20.0 g/L fish meal，15.0 g/L corn steep liquor，60.0 g/L peanut meal，7.5 g/L yeast extract，1.0 g/L Calcium carbonate，0.3 g/L Magnesium sulphate and 0.1 g/L Potassium dihydrophosphate. The pilot fermentation of the strain was successfully carried out in 200 L and 5 000 L fermentor，the LC50 of the fermentation broth were 0.963 mg/L and 0.852 mg/L respectively. The LC50 of the prepared raw powder obtained from post-treatment of the fermentation broth were 0.018 9 mg/L and 0.022 3 mg/L respectively.

Key words： Bacillus sphaericus； culex quinquefasciatus； medium； optimization

蚊蟲是重要的傳染病傳播媒介，化學殺蟲劑在蚊蟲防治中發揮了重要作用[1]。隨著蚊蟲抗藥性的發展及人們對環境安全的重視，研究者進行了生物殺蚊劑的開發，發現了兩類重要的蚊蟲病原細菌，蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis，簡稱Bti）[2]和球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）[3]。與蘇云金芽孢桿菌以色列亞種相比，球形芽孢桿菌的殺蚊譜較窄，但其對庫蚊屬幼蟲的毒性更強，且在污水中的藥效維持時間較長，特別適用于污水中孳生的庫蚊屬幼蟲（淡色庫蚊和致倦庫蚊）的控制[4，5]。中國目前已有球形芽孢桿菌BS-10及C 3-41等菌株實現了商品化，并開展了大面積的應用試驗[6]。也有研究者對分離的球形芽孢桿菌的發酵培養基進行了優化[7，8]。球形芽孢桿菌的工業化生產受到其發酵水平的限制，目前應用還不是十分廣泛。筆者在進行殺蟲細菌的篩選研究中分離到一株對庫蚊幼蟲高毒的球形芽孢桿菌NBIM-311菌株，本試驗主要選取來源廣泛、價格便宜的農副產品作為原材料，對該菌株發酵培養基進行優化，以提高發酵水平。

1 材料與方法

1.1 菌株與材料

本試驗所用的球形芽孢桿菌NBIM-311菌株由湖北省生物農藥工程研究中心菌種室分離篩選并保藏；斜面活化培養基為常規牛肉膏蛋白胨培養基；單因素篩選原料為9種常見的市售農副產品：玉米粉、魚粉、酵母粉、玉米漿、工業蛋白胨、蠶蛹粉、花生粕、豆粕、酵母膏；致倦庫蚊4齡幼蟲由湖北省生物農藥工程研究中心養蟲室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素篩選 根據球形芽孢桿菌的營養特性，不能利用葡萄糖、蔗糖等糖類物質，只能利用蛋白質、氨基酸等作為能源物質[9]，選取玉米粉、魚粉、酵母粉、玉米漿、工業蛋白胨、蠶蛹粉、花生粕、豆粕、酵母膏作碳氮源，各原材料用量均為50.0 g/L，玉米漿用量按干物質含量折算，滅菌前pH 7.5，分裝于500 mL三角瓶，每瓶裝量25 mL，滅菌30 min。挑取一環菌苔接種于搖瓶中，置于旋轉式搖床振蕩培養，溫度30～32 ℃，轉速220 r/min，培養至芽孢40%分離時下搖床，發酵液進行鏡檢和生物測定。

1.2.2 正交試驗 選取魚粉、玉米漿、花生粕、酵母膏作碳氮源，進行4因素3水平正交試驗（表1），無機鹽保持不變，分別為碳酸鈣1.0 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀0.1 g/L，按表1各濃度要求配制培養基，滅菌前pH 7.5，分裝于500 mL三角瓶，每瓶裝量25 mL，滅菌30 min。培養條件同“1.2.1”，發酵液進行鏡檢和生物測定。

1.2.3 200 L發酵罐發酵 按正交試驗篩選到最佳培養基組分配制好培養基，投料體積120 L，消泡劑2.0 g/L，滅菌前pH 7.5，1×105 Pa滅菌30 min。待溫度降至32 ℃時接入經80 ℃水浴20 min的孢子懸浮液，通氣比1∶0.5～1.2，罐壓0.5×105 Pa，培養溫度30～32 ℃，發酵過程中取樣鏡檢，芽孢40%分離時結束發酵。將發酵液pH調至4.5，過100目篩，臺式離心機離心，3倍濃縮，所得菌漿冷凍干燥得到原粉，對發酵液和凍干粉進行生物測定。

1.2.4 5 000 L發酵罐發酵 按正交試驗篩選到最佳培養基組分配制好培養基，投料體積3 000 L，消泡劑1.0 g/L，滅菌前pH 7.5，1×105 Pa滅菌30 min。待溫度降至32 ℃時接入經80 ℃水浴20 min處理的孢子懸浮液，通氣比1∶0.5～1.0，罐壓0.5×105 Pa，培養溫度30～32 ℃，發酵過程中取樣鏡檢，芽孢40%分離時結束發酵。將發酵液pH調至4.5，過100目篩，碟片式離心機離心，3倍濃縮后的菌漿經高速離心式噴霧干燥機進行噴霧干燥，得到原粉，對發酵液和原粉進行生物測定。

1.2.5 生物測定 供試蟲為致倦庫蚊4齡幼蟲，參照袁志明等[8]的方法進行生物測定。

2 試驗結果與分析

2.1 單因素篩選

NBIM-311菌株在不同的碳氮源培養基中搖瓶發酵結果如表2。從表2中可以看出，魚粉、玉米漿、花生粕、酵母膏均能被較好利用，其中花生粕同步率最高95%，菌體形態好，魚粉、玉米漿其次，酵母膏同步率85%，菌體大小較一致，玉米粉、酵母粉、工業蛋白胨、蠶蛹粉、豆粕利用能力差，鏡檢極少量菌體。根據試驗結果，選取魚粉、玉米漿、花生粕、酵母膏作進一步試驗的碳氮源物質。

2.2 正交試驗

魚粉、玉米漿、花生粕、酵母膏的L9（34）正交試驗結果如表3和表4。從表3和表4方差分析結果表明，這4種原材料主效應排序為魚粉>酵母膏>花生粕>玉米漿。魚粉的F值為2.581，對發酵的影響最大，而玉米漿、花生粕對發酵的影響不是很大。確定最佳配方為魚粉20.0 g/L，玉米漿15.0 g/L，花生粕60.0 g/L，酵母膏7.5 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀0.1 g/L。

2.3 200 L發酵罐發酵

發酵周期31 h，發酵21 h時取樣鏡檢，孢囊形成率為95%，菌體大小整齊。放罐時取樣鏡檢， 40%左右脫落，營養體少，芽孢大小整齊。將發酵液和冷凍干燥粉進行生物測定，發酵液對致倦庫蚊的致死中濃度為0.963 mg/L，冷凍干燥粉對致倦庫蚊的致死中濃度為0.018 9 mg/L。

2.4 5 000 L發酵罐發酵

在湖北康欣農用藥業有限公司車間進行3個批次5 000 L罐發酵，離心濃縮，噴霧干燥得到原粉。分別對這3批發酵液和原粉取樣進行生物測定，結果見表5。

3 小結與討論

通過單因素碳氮源篩選和正交試驗，獲得NBIM-311菌株最佳培養基配方為魚粉20.0 g/L，玉米漿15.0 g/L，花生粕60.0 g/L，酵母膏7.5 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀0.1 g/L。筆者在采用單因素試驗時發現以花生粕作為碳氮源所得到的發酵液的毒力較高，與管玉霞等[10]的結果類似。采用該配方進行了200 L和5 000 L發酵罐試驗，發酵液效價和經過后處理所得原粉效價均達到較高水平。但該菌株在200 L發酵罐中的發酵水平與其在5 000 L發酵罐的發酵水平存在差距，究其原因，筆者認為可能與發酵過程中中間控制工藝包括培養溫度、通氣量、攪拌轉速以及后處理過程中的濃縮和干燥方法等有關。擬對該菌株的發酵工藝和后處理工藝技術的優化開展研究。

參考文獻：

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