聚肌胞對禽流感油乳劑疫苗的體液免疫增強作用研究

黃艷艷+李悅+張琳+馬鑫鑫+許傳田+張秀美+劉思當+吳家強

摘要：為了研究聚肌胞是否能夠增強油乳劑滅活疫苗免疫后雞群的體液免疫應答，將3個不同來源的聚肌胞產品與H5亞型禽流感病毒滅活抗原相混合，使用輕質礦物油乳化制備疫苗，分別免疫21日齡SPF雞，同時設置添加抗菌肽的疫苗免疫組、常規油乳劑疫苗免疫組以及不免疫對照組。在免疫后第14、21、28、35 d分別翅下靜脈采集SPF雞抗凝血，通過血凝抑制試驗檢測雞血清中禽流感抗體的水平，使用統計學方法評價疫苗中添加聚肌胞對雞群體液免疫反應的影響。結果發現，添加了聚肌胞或抗菌肽的疫苗免疫后，雞血清中禽流感抗體水平顯著高于普通油苗組。另外，不同來源的聚肌胞產品（PIC-1、PIC-2和PIC-3）免疫增強作用存在差異，以PIC-1免疫增強效果最好。在PIC-1疫苗免疫后，雞血清抗體增長快，且可維持較高水平。總之，本研究表明聚肌胞是良好的禽病毒性疫苗免疫增強劑；不同廠家的聚肌胞產品質量有差異，應擇優使用。

關鍵詞：聚肌胞；免疫增強劑；雞；禽流感；疫苗

中圖分類號：S852.4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0100-04

Abstract To evaluate the efficacy of poly I∶C （PIC） as adjuvant for avian influenza vaccines， three different sources of PIC were mixed with viral antigens of H5 avian influenza virus， and oil emulsion vaccines were developed. Twenty-one-day-old specific-pathogen-free （SPF） chickens were vaccinated with either vaccine. Meanwhile， an unvaccinated chicken group， a cecropin-added oil emulsion vaccine group and a common oil emulsion vaccine （vaccine control） group were set. Chicken blood was collected on the 14th， 21st， 28th and 35th day after vaccination to test serum antibody levels against avian influenza by hemagglutination inhibition assay. Statistic analysis showed that chickens vaccinated with PICs or cecropin adjuvant developed significantly higher antibody level compared to the vaccine control group. Further， PIC of different sources （PIC-1， PIC-2 and PIC-3） showed varied immune-enhancing effects and that of PIC-1 was the best. After vaccinated with PIC-1， the serum antibody of chickens increased fast and could maintain at higher level. In conclusion， PIC is a better promising adjuvant for chicken viral vaccine， and its efficacy may vary due to the sources.

Keywords Poly I∶C；Immunopotentiator； Chicken； Avian influenza； Vaccine

禽流感是危害我國養禽業的一類重要傳染病，我國采取滅活疫苗免疫和撲殺相結合的措施應對高致病性禽流感在家禽中的傳染[1]。疫苗的普遍采用極大程度上降低了禽流感易感家禽的比例，對禽流感的防控起到了積極作用。油乳劑滅活疫苗與活疫苗相比，免疫保護產生得慢，因此生產上迫切需要改進型的禽流感滅活疫苗，以縮短疫苗免疫后的保護空白期，提高疫苗對雞群的保護效率。新型免疫增強劑如干擾素、白介素、細胞模式識別受體激動劑等可有效增強機體的細胞/體液免疫應答，縮短疫苗使用后的免疫保護空白期，因此成為近年來的研究熱點[2，3]。

聚肌胞（poly I∶C， PIC）是人工合成的病毒雙鏈RNA（double-stranded RNA， dsRNA）類似物，可替代病毒dsRNA用作Toll樣受體3（TLR3）和維甲酸誘導基因I受體（RLR）的激動劑[4]，目前已有多個含PIC的抗病毒和抗腫瘤藥物的報道[5]。本課題組以雞源細胞和SPF雞為模型所做的試驗表明，PIC轉染后可迅速激活細胞和雞體的固有免疫應答，引起細胞模式識別受體（TLR3和MDA5）和細胞因子（IFN-β、IFN-γ和IL-6）基因轉錄水平的迅速上調（另文報道）。此外，有研究表明PIC對獲得性免疫也有顯著增強作用[6]。國內也有將PIC用作家禽抗病毒藥物和疫苗佐劑的報道，但應用效果不一[7-11]。本研究中，筆者在禽流感油乳劑滅活疫苗中添加不同來源的聚肌胞，檢測其對雞體液免疫應答的影響，為禽流感滅活疫苗的改進提供依據。

1 材料與方法

1.1 免疫增強劑溶液的配制

丁胺卡那霉素耦合聚肌胞PIC-1、PIC-2和PIC-3分別購自國內3個生產廠家，使用pH 7.4 PBS配制2 mg/mL的溶液。作為對照的天蠶素抗菌肽（Cecropin）為中農穎泰產品，使用滅菌生理鹽水配制2 mg/mL的溶液。置于-20℃保存備用。endprint

1.2 病毒、抗原、白油和疫苗配制

H5亞型禽流感油乳劑疫苗（普通油苗）和添加免疫增強劑的禽流感油乳劑疫苗，均在某疫苗公司定制，使用進口低粘度白油作為佐劑（法國道達爾公司產品）。血凝抑制試驗（hemagglutinin-inhibitation test， HI）抗原亦由上述疫苗公司提供。添加免疫增強劑的禽流感油乳劑疫苗的制備工藝如下：將聚肌胞或抗菌肽分別與含4%Tween-20的病毒抗原混合作為疫苗水相，白油中加入Span-80作為油相，水相和油相以2∶5的比例混合，乳化制苗。疫苗中PIC的終濃度為170 μg/mL，抗菌肽的終濃度為15 μg/mL。

1.3 SPF雞和采血器材

21日齡SPF白色來航雞，購自山東省農業科學院家禽研究所SPF雞研究中心。一次性蝶形采血針和EDTA抗凝真空采血管，為北京美科美加生物科技有限公司產品。

1.4 SPF雞免疫試驗

試驗分為6組（表 1），其中包括普通油苗免疫組1個、含免疫增強劑油苗免疫組4個以及健康對照組1個，每組各10只雞。除健康對照外，其它組別的雞只通過頸部皮下接種相應的疫苗（0.3 mL/只）。在免疫后第14、21、28、35 d，分別經翅下靜脈采集每只雞的血液并以EDTA抗凝，然后分離血清，凍存備用。

1.5 疫苗免疫后雞血清抗體產生情況分析方法

HI試驗檢測雞血清的禽流感病毒抗體效價，比較不同疫苗免疫后血清抗體產生速度和水平：（1）比較含免疫增強劑油苗和普通油苗免疫后的抗體情況，評價疫苗中添加免疫增強劑對雞體液免疫的作用；（2）比較含不同免疫增強劑的疫苗免疫后的抗體情況，評價不同免疫增強劑對雞體液免疫的作用。使用t檢驗（Students t-test，Microsoft Excel 2007）的單因子方差分析對各試驗組抗體水平進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異非常顯著，P<0.001為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 試驗期間雞群狀況和雞血清抗體檢測結果

試驗期間，所有雞只采食、飲水正常，疫苗免疫后雞群未見有不良反應。健康對照組的雞只在4次抗體檢測中均未測到禽流感HI抗體，而各免疫組血清抗體水平隨著時間推移逐漸增高（表1）。

2.2 禽流感抗體水平差異顯著性檢驗結果

表2為單因子方差分析疫苗中添加免疫增強劑的作用結果，表明在免疫后第14 d，PIC-1和PIC-3組抗體水平顯著或非常顯著高于普通油苗對照組；在免疫后第21 d，添加了聚肌胞的各免疫組血清抗體水平顯著或極顯著高于普通油苗組；在免疫后第28 d，PIC-1疫苗組的血清抗體水平非常顯著高于普通油苗組（P<0.01）；在免疫后第35 d，PIC-1和PIC-2免疫組的血清抗體水平顯著或非常顯著高于普通油苗組。

不同免疫增強劑組間，在4次檢測中PIC-1免疫組HI抗體水平有1～2次顯著高于其它免疫增強劑組；而PIC-2、PIC-3和天蠶抗菌肽組之間的血清抗體水平無顯著差異（P>0.05）。

3 討論與結論

本研究將含有聚肌胞或抗菌肽的H5亞型禽流感油乳劑滅活疫苗免疫SPF雞，檢測了免疫后5周內禽流感血清抗體的產生情況。研究發現，在疫苗水相中添加免疫增強劑能夠顯著增強疫苗免疫后雞抗體應答水平，聚肌胞相比抗菌肽對雞體液免疫的刺激作用更強。

聚肌胞已被證實具有良好的細胞免疫刺激作用[4，12]。由于抗體監測是臨床上評價禽流感疫苗免疫效果的主要手段，本研究從體液免疫的角度著手，測定和分析了添加聚肌胞是否會增強禽流感油乳劑疫苗的體液免疫效果。為避免聚肌胞產品差異對試驗結果的影響，研究選取了3個不同廠家的聚肌胞進行試驗。結果表明，3個聚肌胞產品對禽流感油乳劑疫苗的免疫增強作用的確有差異：其中PIC-1疫苗組在全部4次采樣檢測時的抗體水平與普通油苗組均有顯著差異，表明PIC-1的體液免疫增強效果優于其它2個PIC產品。

總之，本研究表明聚肌胞可促進禽流感油乳劑疫苗免疫后雞體的體液免疫應答，疫苗生產實踐中需甄別PIC產品質量，擇優使用。

參 考 文 獻：

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