基于Pyk2通路探討加味四君子湯對阿霉素腎病大鼠的作用

王菊霞，陳小英，陳雪蘭，劉 文，鄭 京

（福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350004）

基于Pyk2通路探討加味四君子湯對阿霉素腎病大鼠的作用

王菊霞，陳小英，陳雪蘭，劉 文，鄭 京

（福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350004）

目的 基于Pyk2通路探討加味四君子湯對阿霉素腎病大鼠的作用。 方法 將實驗用SD大鼠30只采用隨機數字表法分為正常組、模型組及中藥組，誘導阿霉素腎病大鼠模型。中藥組在阿霉素注射后第7天予中藥灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃。實驗的第7、21、35天分別檢測各組24 h尿蛋白定量及電鏡下觀察大鼠腎組織；檢測各組腎組織中Nephrin、Nephrin mRNA、Pyk2 mRNA、Pyk2、Pyk2磷酸化蛋白水平 （pPyk2）及pPyk2／Pyk2比值。 結果 ①24 h尿蛋白定量：模型組較正常組明顯升高（P＜0.01），中藥組較模型組降低（P＜0.05）。② Nephrin及Nephrin mRNA水平：第21、35天，模型組較正常組均明顯減少（P＜0.01），中藥組較模型組增高（P＜0.05）。③ Pyk2 mRNA水平：第21、35天，模型組和中藥組比正常組均升高（P＜0.05），但第35天，中藥組比模型組明顯減少（P＜0.01）。 ④ pPyk2、pPyk2／Pyk2比值：第 21、35天，模型組較正常組均有上升（P＜0.05和＜0.01），而中藥組比模型組均有降低（P＜0.01）。 結論 阿霉素可通過損傷足細胞，抑制Nephrin蛋白，激活Pyk2蛋白磷酸化引起腎病綜合癥的發生；加味四君子湯可抑制阿霉素腎病大鼠腎組織中Pyk2激活，上調Nephrin蛋白水平，改善腎組織足突病變，減少尿蛋白，進而保護腎小球的濾過屏障作用。

阿霉素腎病；24 h 尿蛋白定量；Nephrin；Nephrin mRNA；Pyk2；pPyk2；Pyk2 mRNA；加味四君子湯

加味四君子湯是治療脾腎氣虛型腎病綜合征常用方劑，目前已在臨床上大量應用，取得了很好療效，并能減少蛋白尿，但該方作用機制尚未明確。我們前期研究發現：阿霉素腎病大鼠腎臟損傷與FAKmRNA、蛋白及其磷酸化的表達有關，加味四君子湯能抑制阿霉素腎病大鼠腎組織中黏著斑激酶（FAK）活化，有效降低蛋白尿［1］。而 Pyk2 是一種胞質酪氨酸激酶，是FAK家族的第2個成員，與FAK密切聯系。他們都參與調節肌動蛋白細胞骨架重組、細胞遷移及有絲分裂和腫瘤轉移的關鍵過程［2］。Du1等［3］發現Pyk2介導肌動蛋白細胞骨架重組，而FAK可以抑制PyK2自磷酸化、黏著定位和肌動蛋白細胞骨架重組，這暗示著FAK和 PyK2之間的平衡對于調節細胞的形態、細胞的遷移和細胞的生長具有重要作用。另有研究［4-5］發現：在FAK基因失活或敲除的情況下，Pyk2出現代償性增多。但在腎臟中，二者的關系尚未見報道，Pyk2和FAK在腎病中的相互關系也不明確。中藥治療蛋白尿的作用是否與Pyk2有一定的聯系需要進一步的證明。本項目研究阿霉素腎病大鼠模型腎組織中Pyk2 mRNA、Pyk2蛋白表達及磷酸化（pPyk2）水平及加味四君子湯對其作用機制。

1 資料與方法

1.1 動物模型建立 健康雄性SD大鼠（由廣東省醫學實驗動物中心提供）30只，體質量180～220 g。用隨機數字表法將大鼠分為正常組、模型組、中藥組各10只。模型組和中藥組經尾靜脈按6.5 mg／kg一次性注射鹽酸阿霉素注射液（海正藥業股份有限公司），正常組經尾靜脈一次性注射同等量生理鹽水。7 d后，每日早上八至九點，中藥組以加味四君子湯 20 mL／（kg·d）灌胃，正常組與模型組以同等量生理鹽水灌胃。分別于第21、35天摘取各組5只SD大鼠的雙腎，沿矢狀面剖開，一部分放入10%福爾馬林中以備免疫組化，一部分放入戊二醛固定液中以備電鏡觀察。

1.2 加味四君子湯制備 組方：生黃芪30 g，赤茯苓 12 g，白術 12 g，丹參 15 g，黨參 10 g，山萸肉 12 g，淮山藥 30 g，生薏苡仁 30 g，蓮子肉 30 g，當歸15 g，金櫻子15 g，桑寄生15 g。制法：① 按比例稱取生藥226 g，浸泡30 min后，用電爐大火加熱至沸騰，再轉文火煎煮30 min后過濾；② 濾渣中加水，大火加熱至沸騰后，再文火煎20 min，再過濾；③ 將兩次濾液混合均勻，加熱濃縮至226 mL，相當于原材料1.0 g／mL。中藥材由福建省藥材公司提供，在福建省人民醫院制劑科統一加工。

1.3 指標檢測

1.3.1 24 h尿蛋白定量測定 分別于第7、21、35天，收集3組SD大鼠24 h尿液，通過雙縮脲比色法檢測尿蛋白水平。

1.3.2 腎組織電鏡檢查 取腎皮質約1 mm×1 mm×1 mm，先用磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）固定（含有3%戊二醛和0.22 mmol／L蔗糖），再用1%鋨酸后固定，并逐級乙醇脫水、環氧樹脂包埋，后用透射電子顯微鏡（日立公司HU-12A型）進行腎臟超微病理學檢查。

1.3.3 免疫組化檢測Nephrin水平及圖像分析采用二步法，應用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0對每例標本隨機選取8個視野進行半定量分析，分析得出nephrin的免疫組化染色光密度，計算其陽性積分光密度（IOD）值，為Nephrin水平。具體操作步驟詳見參考文獻［6］。

1.3.4 Rt-PCR檢測 Nephrin mRNA、Pyk2 mRNA水平 每個樣品取腎組織約50mg，按照經典方法用Trizol試劑、氯仿和異丙醇進行抽提 mRNA。具體操作步驟詳見參考文獻［6］。

1.3.5 蛋白質印跡法檢測Pyk2、pPyk2水平 將腎組織塊稱量后用勻漿器攪碎，按1∶10的比例在勻漿中加入相應的裂解液進行裂解，離心機離心后取上清液，用BCA法測定Pyk2蛋白濃度。加入buffe緩沖液后，100℃溫度下變性，取20 μg進行電泳、轉膜，5 g／L脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（磷酸化Pyk2抗體，總Pyk2抗體，德國CST公司），4℃孵育過夜，同上洗膜后，以山羊抗兔二抗（1∶4 000）孵育 1 h，TBST洗滌充分后，ECL化學發光顯色，X光片顯影。

1.4 統計學方法 用SPSS15.0統計軟件對數據進行處理。計量資料屬正態分布以（x±s）表示，采用方差分析法，采用多元相關分析法分析不同變量間的相關性。

2 結 果

2.1 3組24 h尿蛋白定量比較 見表1。

表1 3組24 h尿蛋白定量比較（x±s）mg／24 h

2.2 3組腎臟組織形態圖 見圖1。電鏡觀察：正常組腎小球足細胞足突排列整齊、清晰，未見微絨毛變性及融合；模型組可見腎小球足細胞腫脹，足突部分或彌漫性融合；中藥組腎小球病變和模型組比較有明顯改善，僅見部分足突融合。

圖1 3組腎臟組織電鏡下形態圖（×10 000）

2.3 3組腎組織Nephrin免疫組化染色圖像及水平 見圖 2，表 2。

圖2 3組腎組織nephrin免疫組化染色圖像比較（PV 兩步法，×400）

表2 3組腎組織Nephrin水平比較（x±s）

2.4 3組腎組織中 Nephrin mRNA、Pyk2 mRNA水平比較 見表3。

表3 3組腎組織中Nephrin、PyK2 mRNA水平比較（x±s）

2.5 3組腎組織 Pyk2、pPyk2及 pPyk2／Pyk2比較見圖3。

2.6 多元相關性分析 尿蛋白與PyK2 mRNA、pPyk2／Pyk2 比值呈正相關（r值分別為 0.653、0.926；P 值分別為 0.003、0.000）。

3 討 論

腎病綜合征臨床類型很多，其中微小病變型最主要臨床特點是大量蛋白尿、低蛋白血癥，而蛋白尿生成病理機制中最為關鍵的是腎小球濾過屏障受損［7］。腎小球足細胞足突間裂孔隔膜是腎小球濾過膜屏障重要組成部分［8］。研究表明Nephrin是構成裂孔隔膜拉鏈狀結構的主要結構蛋白［9］，Nephrin的減少被證明與蛋白尿和腎臟病的進展有關［10－11］。

圖 3 3組腎組織 Pyk2、pPyk2及 pPyk2／Pyk2比較

既往研究表明：機械牽拉下誘導的大鼠腎臟纖維化的實驗模型中發現腎小管中的Pyk2蛋白表達水平明顯增多［12］，而內皮素-1（ET-1）刺激系膜細胞則可以引起Ca2+／PKC依賴的Pyk2活化，進而促進系膜細胞增殖以及腎小球硬化、纖維化［13］。我們前期研究發現：隨著蛋白尿的增多，阿霉素腎病大鼠腎組織中Pyk2 mRNA及pPyk2／Pyk2比值升高，提示Pyk2基因及磷酸化蛋白表達的相對升高可能參與阿霉素腎病大鼠蛋白尿的產生［6］。以上研究均表明Pyk2的激活與腎臟疾病的發生發展密切相關。

中醫認為腎病發生的主要病機是由于稟賦不足，久病體虛，加之起居不慎，外邪入里，損傷肺脾腎，導致肺脾腎三臟虧虛，運化水液功能失常，封藏失職，水濕停聚，泛溢肌膚，故而出現水腫；精微不能輸布，封藏而下泄，則出現蛋白尿、低蛋白血癥。本病本在脾腎，標為風、濕、熱、瘀、濁，臨床常見虛實夾雜，相互影響，相互作用，從而導致病情反復，遷延難愈。加味四君子湯是國家中醫藥管理局“十一五”重點專科“水腫”（原發性腎病綜合征）驗證方案專用處方之一，方中生黃芪補益肺脾之氣，補氣運陽以利水，啟上源，助脾運；黨參性甘溫，補中益氣，助黃芪之力；山茱萸性酸、微溫，補益肝腎，既能補精固澀，又能助陽溫運水濕；薏苡仁、茯苓健脾，利水滲濕；白術、淮山藥補氣健脾，益氣養陰，扶土制水；當歸、丹參補血行氣，活血化瘀。諸藥合用，具有補脾益腎，養血攝精，利水消腫之功效。浙江省中醫院李學銘教授常用此方治療脾腎氣虛型腎病，藥后患者水腫、短氣、乏力、腰膝酸軟、納差、體瘦等癥狀得到明顯改善，且具有明顯降低尿蛋白作用［14］。現代研究證實其能改善脾虛證患者的體液免疫和細胞免疫功能，降低循環免疫復合物水平，提高NK細胞活性，并且可以減少大鼠腎小球NF-kB陽性表達，抑制腎小球基底膜增厚、系膜基質增多，降低阿霉素腎病大鼠尿蛋白、肌酐、尿素氮水平。

本研究發現：加味四君子湯能夠抑制Pyk2磷酸化，降低pPyk2／Pyk2比值，減輕足細胞損傷，減少尿蛋白，從而延緩腎病的進一步發展。

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R285.5

A

1000-338X（2017）06-0027-03

2017-09-05

福建省教育廳科技項目A類（JA13161）

王菊霞（1974—），女，醫學碩士，副主任醫師，主要從事小兒內科的臨床工作。