敵敵畏對斑馬魚急性毒性試驗

胡秀彩 楊小平 呂愛軍? 孫敬鋒

（1.天津農學院水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室 天津 300384）（2.江蘇師范大學生命科學學院 江蘇 徐州 221116）

敵敵畏對斑馬魚急性毒性試驗

胡秀彩1楊小平2呂愛軍1?孫敬鋒1

（1.天津農學院水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室 天津 300384）（2.江蘇師范大學生命科學學院 江蘇 徐州 221116）

為探究農藥對斑馬魚的毒性與安全評價，選用在農業害蟲防治中廣泛使用的有機磷農藥敵敵畏進行急性毒性試驗，以24～96h半致死濃度（LC50）判斷斑馬魚對敵敵畏的敏感性。結果表明，敵敵畏24h LC50、48h LC50、72h LC50、96h LC50分別為66.189mg/L、46.647mg/L、35.836mg/L、33.764mg/L，安全質量濃度（SC）為6.95mg/L。參照我國化學物質對魚類毒性分級標準，判定敵敵畏對斑馬魚急性毒性為Ⅲ級，根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》對魚類毒性等級劃分，可判定敵敵畏對斑馬魚為低毒農藥。

斑馬魚；敵敵畏；急性毒性；半致死濃度；安全質量濃度

斑馬魚（Brachydanio rerio）是最早生活在印度和南亞的一種熱帶魚，目前已經成為遺傳學和毒理學研究的重要模式生物，其具有發育快、易于實驗室飼養、繁殖量大、周期短、胚胎透明以及易于實驗操作等優點。斑馬魚作為一種生態毒理學實驗模式動物，除了具有經濟、觀賞價值外，目前已成為研究脊椎動物胚胎發育及對外界環境變化，如紫外線、重金屬鹽類、農藥、消毒液、工業污水、放射性物質等的良好的研究材料。近年來，我國農業得到了迅猛的發展，特別是南方地區出現了水產養殖與稻田耕作有效結合的科學養殖方式（水產養殖與稻田緊密相鄰、稻田-魚塘水相互交錯使用），直接向水體施藥或農田施用的農藥隨地表和地下徑流等途徑進入水體等情況，使得化學農藥的大量施用對水產養殖業，乃至生態環境帶來了嚴重的影響。我國目前農藥年產量達80萬噸，居世界第二位，而敵敵畏因其具有殺蟲譜廣，廉價易得，對人和高等動物低毒等特性，現已成為使用最為廣泛的有機磷農藥之一。

敵敵畏又名DDVP，學名O,O-二甲基-O-(2,2-二氯乙烯基)磷酸酯，屬于有機磷農藥，具有很高的水溶性，用在農業害蟲和衛生害蟲防治上。近年來，隨著水質環境的惡化和水產養殖業的發展，魚類急性毒性研究備受關注，但多用鯉魚、金魚、草魚等作為試驗對象。斑馬魚急性毒性試驗作為檢測工業污染及水體污染的重要手段之一，目前還未廣泛采用。而在敵敵畏的急性毒性研究中，兩棲類的研究成果較豐富，魚蝦的研究較少，蚯蚓等土壤生物偶有報道。本實驗采用農業生產中最普遍使用的農藥敵敵畏對斑馬魚進行急性毒性試驗，獲得了敵敵畏對斑馬魚的基礎毒理學數據，為漁業生產提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

斑馬魚（平均體長3.9cm，平均體重0.44g）：購于徐州市某花鳥市場；敵敵畏（有效成分含量77.5%，350g劑型乳油）購自湖北沙隆達股份有限公司，現配現用。試驗前在實驗室馴養5d以上，試驗前一天停止喂食，試驗期間也不喂食。試驗在容積為1L的玻璃燒杯中進行，每組隨機放10尾魚。試驗用水為經曝氣48h以上去除余氯后的蒸餾水，試驗期間保持充氣。培養箱溫度為25±2℃。光照/黑暗為12h/12h。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗

參照呂愛軍等試驗方法進行，采用靜水法進行急性毒性試驗。以有效成分含量為77.5%的敵敵畏配制7個不同濃度的試劑系列，并且設一個空白對照，每個濃度及對照組隨機放入10尾試驗魚。試驗開始連續觀察8h，觀察記錄魚的中毒情況（平衡、游動、反應、呼吸、體色變化）以及96h內的死亡情況及開始死亡時間和死亡數目。當魚死亡時，及時撈出，以免污染水質，觀察并記錄其體表特征和內臟表面特征。試驗時間為96h，96h后若仍有活魚，繼續試驗至7d。

1.2.2 數據處理

采用Bliss法計算斑馬魚的半致死濃度LC50，安全質量濃度SC用公式SC=48h LC50×0.3/（24h LC50/48h LC50）2計算。死亡率=死亡試驗魚數/試驗魚總數×100%。

2 結果

2.1 斑馬魚急性毒性試驗結果

敵敵畏對斑馬魚急性毒性試驗結果表明：敵敵畏質量濃度達到60 mg/L以上時，24h內試驗魚出現死亡，48h內全部死亡；敵敵畏的質量濃度為80 mg/L時，2h后個別魚即出現側翻，7h后在底掙扎、腹部朝上、嚴重失衡，12h后完全喪失活動能力，張口喘氣，15h開始出現死亡、30h全部死亡，其中15-24h為試驗魚集中死亡時段；敵敵畏質量濃度達到50mg/L以上，試驗魚在72h內全部死亡。敵敵畏質量濃度低于30mg/L時，7d后仍有存活魚。試驗魚7d時的死亡率相比96h，30mg/L和40mg/L試驗魚的死亡率有所提高。當敵敵畏質量濃度為10mg/L，沒有出現魚死亡，說明此濃度敵敵畏對斑馬魚的毒性作用較小。

2.2 斑馬魚中毒表現及死亡特征

敵敵畏對斑馬魚中毒較慢，斑馬魚剛放入水中時出現急速躥游現象，但很快消失，稍后魚群安靜地沉于水底。適應環境后，魚較多游動，偶有集群現象，既而出現上浮、頂水、尾略下垂、安靜浮于水面現象。隨著中毒程度加深，試驗魚出現顫抖、失衡現象，或沉于水底，或側翻浮于水中部，或弓背、頭朝上、尾朝下立于水中，腹鰭擺動不平衡及展開不全，游動能力減弱甚至喪失，反應遲鈍、呼吸頻率加快、張口喘氣、鰓蓋外掀，最后腮部出血死亡，或側躺沉于水底，或腹部朝上浮于水面，部分魚死亡時嘴、胸鰭張開，出現明顯折彎現象，體色加深(見圖1)。高質量濃度組試驗魚從受試、中毒到死亡的間隔時間短，中毒現象也更明顯。

表1 敵敵畏對斑馬魚的LC50和SC

圖1 斑馬魚中毒特征：魚腮部出血、胸鰭展開（上）、側折彎現象（下）

2.3 LC50值及質量安全濃度（SC）

經過統計學分析，敵敵畏的半致死濃度及質量安全濃度值見表1。結果表明，敵敵畏的安全質量濃度為6.95mg/L。參照我國化學物質對魚類毒性分級標準GB/T 21281-2007(96h LC50≤1.0mg/L時為急性毒性Ⅰ級，1.0mg/L≤96h LC50≤10.0mg/L為急性毒性Ⅱ級，10.0mg/L≤96h LC50≤100.0mg/L為急性毒性Ⅲ級)。敵敵畏的96h LC50為33.764mg/L，由此判定敵敵畏對斑馬魚的急性毒性為Ⅲ級。根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》中農藥對魚類的毒性等級劃分（劇毒，96h LC50≤0.1mg/L；高毒，96h LC50≤1.0mg/L；中毒，1.0 mg/L＜96h LC50≤10.0mg/L；低毒，96h LC50＞10.0mg/L），可判定敵敵畏對斑馬魚為低毒農藥。

3 討論

近年來，針對敵敵畏的急性毒性試驗研究，在蛙、蟾蜍等兩棲類報道較多，在魚、蝦等研究較少。斑馬魚急性毒性試驗作為檢測工業污染及水體污染的重要手段之一，目前鮮有報道。本研究采用農業生產中最普遍使用的有機磷農藥敵敵畏對斑馬魚進行急性毒性試驗，以期為農業生產、水產養殖及魚病防治等方面提供一定的參考依據。在本試驗中，敵敵畏對斑馬魚的安全質量濃度為6.95 mg/L，與韓慶莉等報道敵敵畏對鯽魚幼魚48h、72h和96h的LC50分別為45.1 mg/L、30.4mg/L和23.3mg/L，安全質量濃度為2.3mg/L，與黃周英等報道敵敵畏對金魚24h、48h、72h和96h的 LC50分別為39.17mg/L、33.65mg/L、27.10mg/L和25.94mg/L，安全質量濃度為2.594 mg/L相差較大，說明不同魚類對藥物的敏感性不同。姚慶禎等通過敵敵畏對南美白對蝦幼蝦的急性致毒研究發現，敵敵畏對南美白對蝦幼蝦24h、48h、72h和96h的LC50分別為44.0×10ˉ3mg/L、37.8×10ˉ3mg/L、10.0×10ˉ3mg/L和7.6×10ˉ3mg/L，安全質量濃度為7.6×10ˉ4mg/L，說明蝦類對環境變化較敏感，敵敵畏對蝦類的毒性較強。在敵敵畏的急性毒性研究成果較豐富的兩棲類領域，何海艷等采用常規方法研究了敵敵畏對云南小狹口蛙蝌蚪的急性毒性影響，結果表明敵敵畏對小狹口蛙蝌蚪24h、48h、72h和96h的LC50分別為114.82mg/L、102.33mg/L、81.28mg/L和51.29mg/L。耿寶榮等指出敵敵畏對黑眶蟾蜍蝌蚪96h的LC50為51.61mg/L。以上數據表明敵敵畏對兩棲類的毒性相比較斑馬魚要低一些，但王健鑫等則報道敵敵畏對中國林蛙蝌蚪的安全質量濃度為1.86 mg/L。耿寶榮等對沼蛙蝌蚪進行了敵敵畏的急性毒性試驗，表明敵敵畏對沼蛙蝌蚪24h、48h、72h和96h的LC50分別為9.104mg/L、8.064mg/L、6.304mg/L和5.680mg/L。薛清清等通過敵敵畏的急性毒性試驗測得敵敵畏對紋飾姬蛙蝌蚪24h和48h的LC50為3.91mg/L和1.97mg/L，安全質量濃度為0.15mg/L。以上數據中，敵敵畏對兩棲類的毒性又明顯高于斑馬魚，以此說明兩棲類中不同品種的蛙類對敵敵畏的耐受性存在著顯著的差異。另外，胡霞等在敵敵畏的急性毒性研究中，涉及到了對蚯蚓的毒性，結果顯示，用濾紙接觸法測得敵敵畏對蚯蚓的LD50為0.14g/L，自然土壤法測得敵敵畏對蚯蚓的LD50為1.11g/L。

有機磷農藥主要通過干擾生物神經系統功能對水生生物產生毒害作用。敵敵畏屬神經毒劑，其作用機制是通過它與掌管神經正常沖動傳遞的膽堿酯酶結合，將膽堿酯酶的活力點磷酸化，使膽堿酯酶活力受抑，失去水解乙酰膽堿的能力，從而使動物神經傳導失常，中毒死亡。本實驗中敵敵畏暴露組斑馬魚表現出的急躁不安等癥狀是神經系統中毒的表現。楊先樂等出水生動物處于低濃度的有機磷中也會發生慢性中毒，臨床主要表現為水生動物普遍表現為食欲減退，呼吸困難，食物轉化率下降，隨著新陳代謝水平的降低，生長減緩，甚至停止；有機磷農藥能引起孵化率下降，對胚胎有致畸作用，可使幼體形體彎曲，身體瘦弱，眼睛色素沉淀，失去平衡，行為反常，身體上長出水泡，心包囊擴大，血液循環受阻；有機磷能抑制各組織中的膽堿酯酶活性，也可引起血紅素水平下降，紅細胞數量下降，紅細胞比容降低，血漿脂類總蛋白和碳氫化合物含量降低；當有機磷農藥被攝人后，對肝臟、胰臟、鰓、腸、肌肉等實質性臟器存在毒性效應；嚴重時使這些組織的細胞壞死、破裂，致使其中的RNA和DNA含量降低；在生物體內的累積效應。此外，各種環境的理化因素，魚類的種類、大小、生長條件以及它們的適應能力，水體的硬度、pH值、鹽度、有機物、懸浮物、水溫、溶解氧等都會對魚的死亡率產生影響，這些條件的稍微變化，都會對魚病防治效果產生影響。斑馬魚對環境的變化比較敏感，故以斑馬魚為試驗對象測出的安全質量濃度數據在漁業生產中比較保守，可以放心參考。

本研究結果表明敵敵畏對斑馬魚的急性毒性為Ⅲ級，對斑馬魚的毒性等級為低毒。敵敵畏的安全質量濃度為6.95 mg/L，是漁業生產中常用質量濃度的7-17倍，因而敵敵畏對斑馬魚的毒性較小，提示是斑馬魚的安全藥物用。

（略）

天津市自然科學基金重點項目(16JCZDJC33500，15JCZDJC34000)；國家自然科學基金(31272692)；天津市水產產業技術體系創新團隊（ITTFRS2017009）

胡秀彩，1976年生，女，江蘇徐州人，實驗師，主要從事水產微生物學研究，E-mail:huxiucai@126.com。

呂愛軍，教授，主要從事水產動物疾病與防治方面研究，E-mail:lajand@126.com