金銀花組培快繁技術研究

2018-01-08 13:23:32鄭吉發楊芳

現代農業科技 2017年22期

鄭吉發++楊芳

摘要為在短時間里比較簡便地獲得獲得大量優質的金銀花種苗，采用組培方式選取當年生長健壯的無病蟲害的帶芽莖段為外植體在春季上午露水干燥后取材，清潔處理后，并用75%乙醇溶液15 s和0.1% HgCl2溶液7 min進行常規滅菌[1]。選用MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 0.1 mg/L+糖30 g/L+瓊脂6 g/L生芽誘導培養基進行生芽誘導培養，隨后轉入到MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+糖30 g/L+瓊脂6 g/L的增殖培養基中增殖培養，以求獲得更多的繁殖材料，最后以1/2MS+NAA 2.5 mg/L+活性炭200 mg/L+糖30 g/L+瓊脂6 g/L為生根培養基進行生根培養，并進行馴化移栽。結果表明，利用金銀花當年生長健壯的無病蟲害的帶芽莖段可以獲得健壯的金銀花組培苗。通過轉接后的增殖培養，擴大原有組培苗的數量從而保證大規模種植的用苗需求，同時為其他金銀花組培快繁提供技術借鑒。

關鍵詞金銀花；帶芽莖段；組織培養

中圖分類號 S567.79 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）22-0114-02

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬（Lonicera Japanica Thunb）及同屬多種植物的干燥花蕾，為多年生半常綠藤本植物，既有保健、藥用功能，又有觀賞和生態功能，因而被國務院確定為名貴中藥材之一[2-3]。由于其功效繁多，如清熱消毒、消炎、增加抵抗力、抗病毒等，因而被廣泛應用于制藥、香料、化妝品、食品等領域[4-5]。金銀花的主要功能是清熱解毒，可以在濫用抗生素帶來嚴重后果的情況下發揮其作用，防治SAS、H1N1病毒病[6]。另外，金銀花還含有多種抗氧化活性成分，可降血脂，用于預防治療心腦血管疾病。由于用量逐年增加，許多地區都在嘗試大面積種植。

金銀花一般采用扦插、嫁接、分株或壓條繁殖，繁殖系數小，育苗周期長，且易傳染病菌，品種退化快。由于遇到種苗繁殖這一難題，人工大規模種植都沒取得預期效果[7]。

植物組織培養能保持母株的優良性狀，具有繁殖系數高，可周年生產，可實現金銀花良種苗木規模化工廠生產[7]。本文采用當年生幼嫩的帶芽莖段以組織培養的方式進行金銀花良種的快速繁殖并取得了一定進展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

不同外植體的選擇及取材時間對金銀花組培外植體的存活和誘導芽的形成影響較大。春秋以頂芽為外植體，而4個季度帶有對生葉芽的莖段的滅菌效果較差，易產生褐化、污染和不萌發等情況，成活率很低[8]。為了取材方便，多數仍選用當年生帶葉芽的莖段，接種時剪成1.5～3.0 cm長；也可用頂芽繁殖。2016年3月23日10：00取學院藥材圃種植的當年生長狀況良好、無病蟲害、離地面較高的金銀花頂芽、莖條作試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理。外植體在流水情況下用軟毛刷洗去表面的灰塵和附著物等，再剪成段并在流水下沖洗2～4 h。

1.2.2 滅菌。在超凈工作臺中把清洗好的外植體倒入75%乙醇中滅菌15 s然后倒出酒精，然后用加入1～2滴吐溫—80的0.1% HgCl2消毒5 min，滅菌過程中要用手搖滅菌，以加大滅菌效果，最后用無菌水沖洗6～7次，直到起指示作用的吐溫—80沖淡到不形成泡沫[9]，再在接種盤里用鑷子和解剖刀把材料切成帶有1個頂芽或1～2個腋芽的莖段接種到培養基中培養。

1.2.3 培養。把經表面滅菌的金銀花頂芽或帶側芽的當年生莖段接種在配置好的培養基中培養，培養室條件為溫度23～27 ℃、相對濕度65%～85%、光照強度1 500 lx、光照時間12 h。

2 結果與分析

2.1 啟動培養結果

金銀花啟動培養的培養基為 MS+6-BA.0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+糖30 g/L+瓊脂6 g/L。

在接種室超凈工作臺上按無菌操作要求，將材料接入裝有滅菌后啟動培養基的試管中，每個外植體接1個試管按要求包好試管。為防止污染每接種5～6個外植體對接種工具進行消毒1次。金銀花外植體共接種50個，接好后轉入人工控制的培養室中。在培養室培養5 d后轉接材料開始萌動，經過10 d頂芽開始逐漸變綠，也逐漸伸長。帶腋芽的莖段也變得更綠，剝離葉柄處開始凸起，基部形成的瘀傷組織也漸漸增大，4周后形成叢生芽（表1）。總體上看成活率比較理想，但是出現的問題也不少，在滅菌過程中出現材料失活率大、真菌和細菌污染問題。莖尖失活5株、莖段失活6株，在隨后的培養過程中有4瓶真菌和2瓶細菌污染并出現了1瓶材料褐化。

分析原因：一是材料老嫩不一，滅菌時沒有按材料情況分等級后再進行分批控制時間滅菌，從而導致部分材料滅菌時間過長失活。二是經高溫滅菌的鑷子和解剖刀未充分冷卻就進行操作或者鑷子拿捏材料時用力過大損傷材料。三是人員不正確操作增加了污染幾率。四是滅菌過程中，細菌在應對惡劣環境時形成的一種特殊結構的芽孢，這種芽孢幫助細菌渡過難關。當環境條件恢復后，芽孢又重新變為細菌。

2.2 金銀花增殖培養結果

外植體經誘導培養20 d后，發出多個新芽，30 d后新芽梢長成細嫩的莖段。切取叢芽接種于增殖培養基（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+糖30 g/L+瓊脂6 g/L）中增殖培養，15 d后長出叢生芽，切取叢生芽轉接于新的增殖培養基上，則可以在更短的時間內長出叢生芽，增殖培養次數越多，從接種到長出叢生芽的時間就越短，但不短于1周。若不及時轉接，基部會長出大量玻璃狀物質，且試管苗會迅速長高同時變得纖細，導致苗的質量變差。

在組織培養過程中，要想獲得試管苗的快繁高效性，植物生長調節劑是最重要的因素[10]。為了確定最適的比例，配制了以MS為基本培養基，另加入不同的種類和濃度的激素培養基（表2）。在試驗中發現，6-BA/NAA比值越大，越有利于芽的分化生長。MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L增殖周期為20～25 d，增殖倍數為3～4倍，雖然芽的分化量較少，但分化的芽叢都為有效芽，為最佳培養基。在增殖培養時，所切取的增殖叢生芽苗所保留的腋芽數量對增殖速度有一定影響，將保留2、1個腋芽的叢生芽苗接種在同一培養基上，保留2個腋芽的生長速度明顯比保留1個芽的苗快，理論上達到同樣繁殖系數的年增殖次數前者明顯少于后者3～4次，產苗量大幅度提高。建議在工廠化快繁時，最好采用保留2個腋芽的苗進行快繁。endprint

在增殖培養過程中由于轉接技術有限，仍存在一些污染問題，如接種時手握鑷子的部位過低，試管偏長，在材料接入試管的過程中手握過的部位伸入試管中，接觸試管內壁造成細菌污染。在接種完成后，試管密封不嚴，空氣中的真菌孢子通過封口處的縫隙落入培養基中造成真菌污染。

2.3 誘導生根培養結果

當叢芽苗增殖到一定數量后，要分離成單苗轉入到生根培養基進行生根誘導。一般認為礦物質含量高有利于枝葉的生長，較低時有利于生根。因此，生根培養基多采用1/2 MS或者用1/4 MS培養基。同時，為了壯苗，避免形成其他叢芽，培養基要去掉全部的細胞分裂素，并加入適量的生長素（IAA、IBA等），一般2 d即可見根源基發生，當顏色潔白、生長正常的根長約1 cm時即可馴化移栽[6]，選取生長健壯、高達2.5 cm的無根小苗接種在生根培養基上。培養15 d左右就能長出白色短根。

增殖培養至5月18日，從增殖情況良好的金銀花材料中選取其中粗壯、長度4～5 cm的材料進行生根培養，剩下細小苗繼續留下進行壯苗培養和增殖培養（表3）。

生根培養基為1/2MS+NAA 2.5 mg/L+瓊脂6 g/L+糖30 g/L+活性碳200 mg/L，pH=5.8，其中鐵鹽不減半。

2.4 煉苗與移栽管理

試管苗馴化移栽是植物組織培養的最后關鍵環節。生產實踐中，應根據試管苗與實生苗、試管苗的生存環境與自然環境的差異，人為創設從試管苗生存環境逐漸向室外環境轉化的過渡條件，以確保試管苗的移栽成活率。選取長有3～4 cm幼根的試管苗連培養瓶一起拿到室外煉苗1～2 d，再打開瓶口，注入少量無菌水，水面高出培養基1～2 cm，煉苗2～3 d，到苗長出新葉時煉苗成功。

輕輕取出試管苗小心洗凈根部培養基，再浸泡到多菌靈800～1 000倍液中10 min后移栽，以提高移栽成活率。將處理好的試管苗移入消毒苗滅菌后的基質中（其中珍珠巖∶草木灰∶菜園土=1∶1∶1）。澆透水后用塑料薄膜覆蓋，保持一定濕度，并隱蔽遮光培養，培養10 d左右長出新根。植株生長健壯，成活率達90%以上[11]。

3 結論

金銀花組培快繁所選的材料為當年生幼嫩的帶芽莖段。消毒時間控制得當是啟動培養成功的關鍵。時間過短則滅菌不徹底，時間過長消毒劑對材料的損傷大，直接導致的后果是死亡率高、褐變幾率升高。經過幾次試驗對比，發現所取的材料在75%乙醇中滅菌15 s，然后再在0.1% HgCl2消毒5 min為較恰當的滅菌時間。

金銀花幼嫩的莖條生長速度較快，所帶菌少，通過滅菌消毒以后，基本可以建立外植體的無菌體系。在無菌體系建立后增殖階段是快速高效繁殖的關鍵，對生長調節劑的所選種類及所用濃度有嚴格的要求。在增殖過程中由于金銀花的生長性能較好，對生長素要求不高，一般0.05～0.10 mg/L就可以滿足其生長，由于其細胞增殖能力較差，所以對細胞分裂素濃度的要求較高，但是這些調節物質在金銀花轉接過程中有積累作用，所以每次轉接材料的培養基生長調節物質要比上一次稍低，因為處理不當會使其材料在培養過程中變得很茂盛且又細又長，使材料質量變差，同時要控制培養基的水勢，以防止材料玻璃化。金銀花材料增殖次數不宜過多，這是因為過多則造成分化能力下降，物種抗病能力下降，基因容易發生突變、轉型。

試管苗在大田移栽成活意味著整個組培育苗的成功，進而才能達到大規模、快速、高效育苗的目的。在植物組織培養過程中，如何做好試管苗的馴化移栽工作成為重點。在（下轉第119頁）

（上接第115頁）

生產實踐中應根據試管苗與實生苗、試管苗的生存環境與自然環境的差異，人為地創設過渡條件，使試管苗能夠成功地向室外環境轉化，提高移栽成活率[12]。

本文用當年生幼嫩的帶芽莖段以組織培養的方式進行金銀花良種的快速繁殖，同時進行觀察、比較、討論、分析金銀花生產中的部分問題，找出問題的原因，制定解決方案，以擴大金銀花種植面積、提高金銀花總產量。

4 參考文獻

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