生姜脫毒快繁與病毒檢測(cè)技術(shù)研究

肖雅+雷艷+楊建國(guó)+卜曉云+肖騁+左小義

摘要 本文以感染TMV和CMV的湘西本地小黃姜為試材，采用熱處理、莖尖培養(yǎng)結(jié)合添加病毒唑的方法進(jìn)行脫毒處理以獲得無(wú)病毒的優(yōu)質(zhì)生姜種苗，運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)病毒，以期探討出生姜最適宜的脫毒快繁及病毒檢測(cè)技術(shù)。結(jié)果表明，將生姜塊莖置于40 ℃條件下催芽，顯微鏡下剝?nèi)?.2～0.5 mm的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+病毒唑40 mg/L，繼代培養(yǎng)基中將MS培養(yǎng)基中的蔗糖濃度調(diào)整為80 g/L，即可實(shí)現(xiàn)生姜試管苗的增殖、生根及壯苗的一步培養(yǎng)，培養(yǎng)周期以30～40 d為宜。建立了一套生姜CMV和TMV 2種病毒的RT-PCR檢測(cè)體系，運(yùn)用該檢測(cè)方法對(duì)生姜脫毒試管苗進(jìn)行檢測(cè)，病毒檢出率為0，生姜脫毒率達(dá)100%。

關(guān)鍵詞 生姜；莖尖脫毒；同步培養(yǎng)；病毒唑；病毒檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào) S632.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）22-0049-03

Abstract In order to obtain high quality ginger seedlings without virus，the yellow ginger of Xiangxi three main virus detoxification methods were studied.Taking TMV and CMV infection Yellow ginger of Xiangxi as experimental materials，the heat treatment，stem tip cultivation method of adding ribavirin combination，in the process of test using RT-PCR method to detect virus，the most suitable detoxification and virus detection technology of ginger were discussed.The results showed that while putting the ginger tuber for germination at 40 ℃，and then wring 0.2-0.5 mm size stem tip under the microscope for culturing.The optimal medium for induction was MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+virazole 40 mg/L.In the subculture medium，when the sucrose concentration in the MS medium was adjusted to 80 g/L，the ginger test tube′s proliferation，taking root and strong seedlings can be realized by one step，and the suitable culture cycle is 30-40 days.A RT-PCR detection system for CMV and TMV viruses was established.The virus detection rate of ginger detoxification test tube was zero by RT-PCR，ginger detoxication rate is 100%.

Key words ginger；stem tip detoxification；synchronization culture；ribavirin；virus detection

生姜為姜科姜屬多年生宿根植物，營(yíng)養(yǎng)豐富，是藥、食、加工等多用途經(jīng)濟(jì)作物，是我國(guó)重要的外貿(mào)產(chǎn)品。湘西自治州地處我國(guó)生姜主產(chǎn)區(qū)，生姜種植歷史悠久，全州生姜種植面積約3 333.33 hm2 [1]。生姜在生產(chǎn)上長(zhǎng)期采用無(wú)性繁殖，重茬種植，易感染多種病毒，使姜體內(nèi)積累多種病毒，從而導(dǎo)致生姜產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低，種性退化，嚴(yán)重制約了生姜的生產(chǎn)發(fā)展。國(guó)內(nèi)外目前尚無(wú)高抗病毒的生姜品種和高效殺病毒藥劑，因此，亟需通過(guò)組織培養(yǎng)手段對(duì)現(xiàn)有優(yōu)良品種進(jìn)行脫毒和復(fù)壯，提高品種自身抗逆性和增產(chǎn)潛力。研究表明[2-3]，侵染生姜的病毒主要為黃瓜花葉病毒（CMV）和煙草花葉病毒（TMV），病毒與姜競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)成分，使生姜出現(xiàn)局部或系統(tǒng)花葉褪綠、植株矮化或葉畸形等癥狀，從而導(dǎo)致生姜產(chǎn)量降低 30%，嚴(yán)重者可減產(chǎn) 45%以上，且品質(zhì)和抗性也會(huì)受到不同程度的影響。因此，探索出一套生姜種苗脫毒快繁體系以及病毒檢測(cè)技術(shù)是提高生姜產(chǎn)量和品質(zhì)的有效途徑。本文以湘西小黃姜為材料，利用熱處理、莖尖培養(yǎng)及化學(xué)藥劑相結(jié)合的方法進(jìn)行生姜脫毒，并用RT-PCR 檢測(cè)病毒，以期建立一套生姜脫毒快繁體系，為脫毒姜種的快速繁殖提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用感染TMV和CMV的湖南湘西本地小黃姜為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熱處理催芽。將試驗(yàn)材料置于干凈的沙盤(pán)中，上面覆蓋約3 cm厚的細(xì)沙，噴水使河沙濕潤(rùn)（以沙盤(pán)內(nèi)不積水為宜），河沙上用濕毛巾覆蓋，置于人工光照培養(yǎng)箱內(nèi)（設(shè)置溫度：40 ℃，濕度：70%，光照：0）培養(yǎng)，4～6周后待芽長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)取出。

1.2.2 莖尖脫毒。待種姜芽點(diǎn)萌發(fā)至1～2 cm時(shí)，選取粗壯的芽，用解剖刀切下，放入器皿中用洗衣粉等清潔劑沖洗20 min，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)進(jìn)行操作，將芽段放入滅菌后的燒杯內(nèi)，用75%酒精清洗30 s，無(wú)菌水沖洗1次，再用0.1% HgCl溶液浸泡20 min，最后用無(wú)菌水沖洗5～6次。將完成消毒滅菌操作的生姜芽段放在無(wú)菌濾紙上吸干水分，在30～40倍解剖鏡下用無(wú)菌的解剖刀、解剖針剝?nèi)?個(gè)葉原基的莖尖（大小0.2～0.5 mm），將生長(zhǎng)點(diǎn)迅速按無(wú)菌操作程序接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。endprint

1.2.3 基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選。據(jù)研究表明[4-7]，添加6-BA 1.0～3.0 mg/L、NAA 0.1～1.0 mg/L時(shí)，對(duì)誘導(dǎo)生姜的生芽分化具有很大的作用。本試驗(yàn)設(shè)置12個(gè)處理（表2），記錄接種30 d后的成活率、出芽時(shí)間及出芽率，篩選出最佳的基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.4 不同濃度病毒唑?qū)ι摱拘Ч挠绊憽Ｒ?.2.3中的基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的病毒唑，共設(shè)置6個(gè)處理，分別為0（B1）、5 mg/L（B2）、20 mg/L（B3）、40 mg/L（B4）、80 mg/L（B5）、150 mg/L（B6）。觀察記載每個(gè)處理的成活率和出芽率。以每個(gè)處理為一個(gè)株系，對(duì)每個(gè)株系進(jìn)行擴(kuò)繁，根據(jù)抽樣方法（見(jiàn)1.2.6）對(duì)每個(gè)株系的擴(kuò)繁試管苗進(jìn)行病毒檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理下的生姜脫毒率。

1.2.5 增殖與生根培養(yǎng)基的篩選。觀察接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基的芽點(diǎn)，待苗長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，整株取出接入培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖與生根培養(yǎng)。有研究表明[8]，蔗糖濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)試管姜的誘導(dǎo)及膨大具有重要作用。本試驗(yàn)中的增殖培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不添加任何激素，設(shè)置5個(gè)不同的蔗糖濃度處理，分別為30 mg/L（C1）、50 mg/L（C2）、80 mg/L（C3）、100 mg/L（C4）、120 mg/L（C5）。觀察記載每個(gè)處理在不同時(shí)間下的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)生根誘導(dǎo)率及增殖倍數(shù)。

1.2.6 病毒檢測(cè)方法。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（Reverse Transcription-PCR，RT-PCR）進(jìn)行病毒檢測(cè)。

檢測(cè)對(duì)象為煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）。抽樣方法：用作繁育基礎(chǔ)苗的每塊姜塊都必須檢測(cè)，每塊姜塊取小部分即可，其余大部分姜塊用作擴(kuò)繁的脫毒材料。由一個(gè)生姜姜塊繁育而來(lái)的試管苗為同一個(gè)株系，每個(gè)株系隨機(jī)抽取1%～2%的增殖苗進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)株系取樣3個(gè)以上。植物總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄方法根據(jù)TransGen Biotech公司的EasyPure RNA Kit和TransScriptR Two-Step RT-PCR SuperMix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系：采用50 μL PCR反應(yīng)體系，包含模版2 μL，正向和反向引物（根據(jù)Genebank中已報(bào)道的序列，通過(guò)Primer 5軟件設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1）各2 μL，10×TransTaq-T buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，TransTaq-T DNA polymerase 0.5 μL，最后加ddH2O至50 μL。取8 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，5 V/cm恒壓條件下電泳30 min左右，在柯達(dá)凝膠成像系統(tǒng)下觀察并照相保存。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)為參照，觀察是否有目的基因大小的條帶出現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同配比的6-BA和NAA，接種培養(yǎng)觀察，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，處理A3、A4、A8中，當(dāng)6-BA的濃度≤NAA時(shí)，接入培養(yǎng)基的生姜芽點(diǎn)成活率很低，出芽率為0；當(dāng)6-BA加入量為1 mg/L和3 mg/L時(shí)，無(wú)論添加多大濃度的NAA，所有處理的成活率及出芽率都很低，出芽時(shí)間長(zhǎng)，說(shuō)明低濃度的6-BA不能很好地誘導(dǎo)生姜芽點(diǎn)的萌發(fā)，高濃度的6-BA抑制生姜芽點(diǎn)的萌發(fā)；當(dāng)6-BA加入量為2 mg/L時(shí)，處理A5、A6均有較高的成活率及出芽率，出芽時(shí)間也較短，其中以處理A6為最佳處理，接入的生姜芽點(diǎn)于30 d左右開(kāi)始轉(zhuǎn)綠出芽，成活率高達(dá)86.7%，出芽率為83.3%，出芽時(shí)間最短。說(shuō)明基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中最佳激素配比為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

2.2 不同濃度病毒唑?qū)ιo尖生長(zhǎng)及脫毒率的影響

在最佳基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加不同濃度的病毒唑，接種培養(yǎng)觀察，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中未添加病毒唑時(shí)，生姜莖尖的成活率和出芽率最高，但脫毒率相對(duì)較低，僅為69%，說(shuō)明病毒唑的加入有抑制病毒生長(zhǎng)的作用。隨著病毒唑濃度的增加，生姜莖尖的成活率和出芽率有所下降，但脫毒率呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明病毒唑?qū)χ仓甑纳L(zhǎng)具有一定的抑制作用。當(dāng)加入的病毒唑濃度 ≥40 mg/L時(shí)（處理B4、B5、B6），脫毒率達(dá)到100%。綜合3個(gè)測(cè)量指標(biāo)，處理B4為最佳處理，脫毒率達(dá)到100%，成活率和出芽率為90%，當(dāng)病毒唑濃度增加時(shí)，成活率和出芽率都有所下降，對(duì)生姜生長(zhǎng)的抑制作用愈加明顯。

2.3 不同蔗糖濃度對(duì)生姜組培苗增殖及生根的影響

MS培養(yǎng)基中加入不同的蔗糖濃度，以期實(shí)現(xiàn)生姜增殖和生根的同步培養(yǎng)，接種培養(yǎng)觀察，結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，普通的MS培養(yǎng)基（C1）中，即使生長(zhǎng)周期達(dá)到40 d，生姜組培苗也幾乎沒(méi)有增殖，隨著蔗糖濃度的增加，生姜組培苗的增殖率和生根誘導(dǎo)率也越來(lái)越高。處理C3、C4、C5的的增殖倍數(shù)都較高，生根誘導(dǎo)率在培養(yǎng)周期為30 d時(shí)，都達(dá)到了100%，處理C4和C5試管苗的增殖和生根率雖然都較高，但均出現(xiàn)了葉片黃化、莖桿矮粗的現(xiàn)象，說(shuō)明培養(yǎng)基中糖濃度過(guò)高不適宜生姜試管苗的生長(zhǎng)。綜合比較，生姜的增殖和生根培養(yǎng)基以處理C3為最佳處理，即MS培養(yǎng)基中蔗糖濃度調(diào)整為80 g/L時(shí)，生姜試管苗的增殖率和誘導(dǎo)生根率達(dá)到最高，長(zhǎng)勢(shì)也最好，實(shí)現(xiàn)了增殖、生根及壯苗的一步培養(yǎng)，培養(yǎng)周期以30～40 d為宜。

2.4 RT-PCR檢測(cè)生姜感病率

運(yùn)用RT-PCR方法對(duì)用作繁育基礎(chǔ)苗的每塊姜塊進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，所檢測(cè)的樣品均出現(xiàn)了323 bp和237 bp的病毒特異性條帶（圖1），條帶很亮，說(shuō)明本試驗(yàn)的RT-PCR體系非常適合2種病毒的檢測(cè)，所有檢測(cè)的樣品呈陽(yáng)性，均感染了CMV和TMV病毒，可用作進(jìn)一步脫毒用的生姜材料。運(yùn)用本方法對(duì)不同濃度病毒唑處理下的生姜脫毒試管苗進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表3所示。endprint

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過(guò)對(duì)生姜脫毒方法的研究，篩選出最佳方法：運(yùn)用熱處理（40 ℃）對(duì)生姜塊莖進(jìn)行催芽，在顯微鏡下剝?nèi)?.2～0.5 mm的莖尖，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出芽，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+病毒唑40 mg/L，30 d左右，芽點(diǎn)轉(zhuǎn)綠，50 d左右，待苗長(zhǎng)至2～3 cm高，轉(zhuǎn)至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基中僅僅將MS培養(yǎng)基中的蔗糖濃度調(diào)整為80 g/L，即可實(shí)現(xiàn)生姜試管苗的增殖、生根及壯苗的培養(yǎng)，培養(yǎng)周期以30～40 d為宜。該培養(yǎng)基配方顛覆了一般增殖及生根培養(yǎng)基必須使用激素的傳統(tǒng)，大大提高了培養(yǎng)效率，降低了生產(chǎn)成本。

建立了一套生姜CMV和TMV 2種病毒的RT-PCR檢測(cè)體系，運(yùn)用該方法對(duì)用于脫毒的生姜試驗(yàn)材料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)清晰的病毒特異性條帶，說(shuō)明該方法能夠快速靈敏地檢測(cè)出這2種病毒。建立了一套生姜CMV和TMV 2種病毒的RT-PCR檢測(cè)體系，運(yùn)用該檢測(cè)方法對(duì)生姜脫毒試管苗進(jìn)行檢測(cè)，病毒檢出率為0，生姜脫毒率達(dá)100%。

3.2 討論

3.2.1 生姜脫毒方法。目前，植物的脫毒方法主要有熱處理、莖尖培養(yǎng)和化學(xué)藥劑處理等。莖尖培養(yǎng)是目前使用最廣泛的脫毒方法，剝?nèi)〉那o尖越小，脫除病毒效果越好，但同時(shí)存在成活率低下、易褐化死亡等問(wèn)題，對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高，脫毒率的高低也有一定的偶然性，因而僅以此一種方法難以達(dá)到預(yù)期的效果[9]。高溫?zé)崽幚砟苁共《锯g化，抑制病毒的分化和轉(zhuǎn)移，使其失去活性。有研究表明，添加病毒唑可起到鈍化病毒、抑制病毒生長(zhǎng)的作用，但也存在單獨(dú)使用效果不明顯的問(wèn)題，需結(jié)合其他方法方可達(dá)到理想效果[10]。在生姜脫毒上通常運(yùn)用前2種方法較多，有研究表明，采用高溫38 ℃催芽+超高溫50 ℃ 5 min處理姜芽，對(duì)生姜進(jìn)行莖尖脫毒培養(yǎng)可使試管苗脫毒率達(dá)97.5%以上[11]，但作為生姜原原種來(lái)說(shuō)，脫毒率必須達(dá)到100%。本試驗(yàn)在熱處理和莖尖培養(yǎng)2種脫毒方式的基礎(chǔ)上添加了病毒抑制劑處理的方式，即在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加適宜濃度的病毒唑，使擴(kuò)繁的生姜脫毒試管苗的脫毒率達(dá)到100%，符合作為原原種苗的要求。

3.2.2 病毒檢測(cè)方法。ELISA是目前檢測(cè)生姜組培苗病毒的最常用方法（海南小黃姜脫毒快繁技術(shù)研究），該方法特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、適用于大量田間樣品的檢測(cè)，是目前生產(chǎn)應(yīng)用最便捷、使用最為廣泛的檢測(cè)技術(shù)。隨著病毒檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，本試驗(yàn)中采用的RT-PCR是一種檢測(cè)RNA病毒的行之有效的方法。該方法較ELISA而言，在檢測(cè)樣品量不太大的前提下，檢測(cè)成本更低，有研究表明，其靈敏度更是DAS-ELISA敏感度的1 000倍[12]，具有更高的準(zhǔn)確性。脫毒后的生姜試管苗為生姜原原種苗，對(duì)脫毒率的要求特別嚴(yán)格，必須達(dá)到100%的脫毒率，才能保證后續(xù)種苗的質(zhì)量，因而準(zhǔn)確率更高的RT-PCR方法相較ELISA檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)更為合適，本試驗(yàn)通過(guò)各種試驗(yàn)條件的優(yōu)化，摸索了一套最適合檢測(cè)TMV和CMV 2種病毒的RT-PCR體系，可高效、準(zhǔn)確地獲得病毒檢測(cè)結(jié)果。

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