H2O2對鹽脅迫下羽衣甘藍幼苗生長的影響

李偉+郭君潔+李鴻雁

摘要： 以羽衣甘藍名古屋品種（Brassica oleracea L. var. acephala f. tricolor Hort.）為研究材料，在100 mmol/L NaCl脅迫下，分別使用外源H2O2和H2O2清除劑二甲基硫脲處理。2 d后測定植物的生長速率、干質量、鮮質量和相對含水量，6 h后測定植株體內3個抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性及基因的表達。結果顯示，鹽脅迫下加入0.05 mmol/L外源H2O2，羽衣甘藍幼苗生長速率、干質量、鮮質量、相對含水量、3個抗氧化防護酶的活性和基因表達分別高于鹽脅迫下相關指標；清除內源H2O2，則植物幼苗生長速率、干質量、鮮質量和相對含水量、3個抗氧化防護酶的活性及基因表達分別低于鹽脅迫下相關指標。由此推測，在鹽脅迫條件下，H2O2參與了抗氧化防護基因表達的調控，它可能是鹽脅迫誘導的羽衣甘藍葉片抗氧化防護系統的重要調控因子。

關鍵詞： 羽衣甘藍；H2O2；鹽脅迫；抗氧化酶；基因表達

中圖分類號： S635.901 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0149-04

鹽脅迫是造成作物嚴重減產最常見的逆境條件，提高植物對環境脅迫的抗性，尤其是對鹽脅迫的抗性，是穩定植物生長的首選目標，當植物受到環境脅迫時會產生大量活性氧，包括過氧化（H2O2）、單線態氧（1O2）、羥自由基（·OH）、超氧陰離子（O-2[KG-*2]· ）、脂質過氧基（ROO·）等[1-4]。鹽脅迫能迅速誘導植物體內活性氧的積累，對蛋白質和脂類引起氧化損傷[5]。而植物體內有2種清除保護機制，即酶促系統和非酶促系統，其中酶促系統包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等。研究表明，鹽脅迫能使植物體內活性氧增高[6-8]。近年來，許多試驗表明，H2O2是一種重要的信號分子，當植物細胞在響應于各種脅迫反應時能生成該物質，并進一步調節應激反應的一系列信號轉導[9-14]。有證據顯示，逆境條件下內源H2O2積累能增加植物的抗逆性，過量的H2O2等ROS能引起細胞內大分子氧化損傷；Wahid等的研究表明，過氧化氫預處理可以使細胞膜系統保持完整，繼而提高小麥種子抗氧化能力，增強小麥在萌發過程中的耐鹽性[13]。在植物的抗鹽反應中起到關鍵作用的SOS1（salt overly sensitive）是擬南芥Na+/H+反向轉運體，H2O2能調節其mRNA穩定性。然而，在鹽脅迫誘導下，H2O2與氧化酶活性其表達機理尚不十分清楚。

本試驗研究鹽脅迫下外源H2O2或者清除體內H2O2對羽衣甘藍幼苗生長特性、抗氧化酶活性及相關基因表達的影響，旨在揭示H2O2在植物抗鹽脅迫反應中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年8—10月在黃淮學院實驗室進行。選用羽衣甘藍名古屋品種（Brassica oleracea L. var acephala f. tricolor Hort.） 為研究材料，由駐馬店市南海公園提供。H2O2供體為30% H2O2，H2O2清除劑為二甲基硫脲，均為國產分析純。

1.2 試驗處理

把羽衣甘藍種子，消毒后，用蒸餾水沖洗數次，濾紙吸干。處理后的種子放入墊好濾紙的培養皿中，溫室培養[溫度：（24±2） ℃，光照—黑暗：16 h—8 h，光照度：2 000 lx]。待羽衣甘藍胚根長3～5 mm時，選取胚根整齊一致的幼苗，盆栽。待苗長至10 cm左右，放入Hoagland溶液溫室預培養3 d。3 d 后，分4組進行處理，分別是對照組（CK）：Hoagland溶液；鹽處理組（N）：100 mmol/L NaCl+Hoagland溶液；NaCl+H2O2組（N+H）：100 mmol/L NaCl+0.05 mmol/L H2O2+Hoagland溶液；NaCl+DMTU組（N+DMTU）：100 mmol/L NaCl+5 mmol/L DMTU+Hoagland溶液。處理6 h后，進行SOD、CAT、APX活性分析與基因（SOD，GenBank：JQ321587.1；CAT，GenBank：JF720325.1；APX，GenBank：XM_013733887.1）表達測定。用異硫酸胍法提取葉片內總RNA，ABI7700進行定量PCR，以actin（GenBank登錄號AF111812.1）作為內參（表1），方法參照文獻[15]進行。每處理重復3次，為了保持處理一致性，處理期間每天更換處理液，處理48 h后，分別取羽衣甘藍幼苗測定生長速率，取葉片分別測定干質量、鮮質量和相對含水量，測定方法參照文獻[16]進行。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下外源或清除內源H2O2對羽衣甘藍幼苗生長的影響

研究發現，用50 mmol/L NaCl處理的羽衣甘藍幼苗與對照沒有顯著差異，僅有部分老葉枯萎。在100 mmol/L NaCl脅迫下，羽衣甘藍幼苗受傷害程度增加，上部部分葉片變黃，下部老葉萎蔫。當NaCl濃度達到150、200 mmol/L時，葉片嚴重失水，導致甘藍幼苗全株死亡。因此，在此后試驗中，選擇100 mmol/L NaCl進行處理。在此濃度下，羽衣甘藍幼苗表現出一定的鹽害癥狀，但不會導致植物死亡。預試驗表明，H2O2濃度為0.05 mmol/L時對100 mmol/L NaCl脅迫下羽衣甘藍幼苗生長的影響較為明顯，因此本試驗H2O2濃度為005 mmol/L。

用100 mmol/L NaCl處理羽衣甘藍幼苗的生長受到顯著抑制，植株生長速率、植株地上部鮮質量、干質量和相對含水量與對照相比均下降，且有顯著差異。外源H2O2使鹽脅迫羽衣甘藍幼苗生長速度、鮮質量、干質量和相對含水量與僅鹽脅迫處理顯著增加（圖1）。在鹽脅迫下，用H2O2清除劑DMTU處理，則葉片生長速率、植株鮮質量、干質量和相對含水量與鹽脅迫下相比顯著下降，表明清除H2O2后，鹽脅迫下羽衣甘藍生長受到抑制。endprint

2.2 鹽脅迫下外源H2O2或清除內源H2O2對幾種抗氧化酶活性的影響

當植物體處在脅迫環境中時，抗氧化酶活性通常會增加，以加強對逆境的適應。在100 mmol/L NaCl脅迫條件，羽衣甘藍幼苗SOD酶活性顯著上升，與對照相比有顯著差異，外源0.05 mmol/L H2O2處理與鹽脅迫相比可以顯著提高SOD酶活性（圖2）。說明低濃度外源H2O2能增強抗氧化酶活性。CAT和APX與SOD類似。

2.3 鹽脅迫下外源H2O2或清除內源H2O2對幾種氧化酶基因表達的影響

與對照相比，鹽脅迫條件下，3個基因的表達均有所增加，且SOD、CAT、APX基因表達增加的趨勢相同。加入外源H2O2，3種基因表達量有所提高，與對照有顯著差異。當用H2O2清除劑對鹽脅迫下羽衣甘藍的3個抗氧化防護基因表達進行測定，結果顯示，3種基因的表達量與鹽脅迫相比有所下降，差異顯著（圖3）。

3 討論

當植物受到鹽脅迫時，體內活性氧代謝平衡失調，積累的活性氧導致鹽害[17-18]。因此，本研究中，高濃度的H2O2處理，引起羽衣甘藍幼苗活性氧增加，對鹽脅迫適應性下降，使植物受害加重，生長受到嚴重抑制。近年研究表明，H2O2等活性氧在植物體內也能起到信號轉導作用，微量過氧化氫等活性氧在調節某些生理現象方面起著重要作用，尤其是在細胞信號轉導中的作用。本試驗中采用的0.05 mmol/L濃度H2O2在羽衣甘藍響應鹽脅迫過程中可能發揮了某種信號作用，參與或者影響了鹽脅迫信號轉導過程，從而一定程度地緩解了鹽脅迫對羽衣甘藍幼苗生長的抑制作用。

鹽脅迫能抑制植物的呼吸代謝，這個過程中細胞內ROS大量增加（如H2O2等），對植物造成次生傷害，如細胞膜脂質過氧化。植物為了清除體內ROS，植物體內的抗氧化酶活性會相應提高，增加植物耐鹽能力[19-20]。鹽脅迫下，植物SOD、CAT和APX等抗氧化酶協同作用，清除過多的活性氧，使活性氧代謝處于平衡狀態，保護生物膜的完整性，使其在一定范圍內忍耐鹽脅迫。但是，當活性氧的產生超過了抗氧化系統的消除能力時，植物就會受到傷害[21]。SOD催化O-2發生歧化反應，從而避免O-2對細胞的毒性傷害，而歧化反應過程中所產生的H2O2則由CAT、APX等來清除[22-23]。也有研究認為，H2O2是活性氧信號轉導途徑中的一個重要內源信號分子，在植物對生物和非生物脅迫的抗性中起著重要作用[24]。本試驗結果表明，在鹽脅迫下，3種抗氧化酶活性都比空白對照增強。但在高鹽脅迫下，適當濃度的H2O2能夠提高羽衣甘藍葉片SOD、CAT以及APX的活性，而清除劑處理下，則3種抗氧化酶與僅鹽脅迫處理相比顯著下降。表明低濃度的H2O2鹽脅迫條件下有信號轉導作用。

H2O2作為信號分子也脅迫調節相關的基因表達。在一定條件下，H2O2作為一種信號分子，可以調節一系列相關基因的表達[25-26]。例如，當植物被病原體感染時，植物體內的H2O2誘導PR-1和PAL 基因的表達[27]。有人把豆類植物用 10 mmol/L H2O2處理，其免疫反應中類NOS活性提高近8.3倍。大豆（Glycine max L.）細胞用外源H2O2處理，細胞質APX的轉錄水平顯著提高[28]。如果用APX抑制劑羥基脲或CAT抑制劑氨基三唑處理培養的水稻（Oryza sativa L.）細胞，H2O2的產量明顯增加，它使APX的轉錄水平大幅提高[29]。另有研究表明，H2O2激活促原分裂蛋白激酶（MAPK）進一步增強抗氧化酶防御酶活性[30]。本研究結果表明，在鹽脅迫下，3種抗氧化酶的基因表達受過氧化氫正調控（圖3），表明抗氧化防御系統增加了植物對鹽脅迫的耐受性和內源性過氧化氫的積累有關。

綜上所述，在鹽脅迫條件下，H2O2參與了羽衣甘藍抗氧化保護酶活性的調節，同進也參與了抗氧化酶基因表達調控，它可能是鹽脅迫誘導的羽衣甘藍葉片抗氧化防護系統的重要調控因子。

參考文獻：

[1] Correa N S，Bandeira J D，Marini P，et al. Salt stress：antioxidant activity as a physiological adaptation of onion cultivars[J]. Acta Botanica Brasilica，2013，27（2）：394-399.

[2]Harpreet K，Sirhindi G，Bhardwaj R. Alteration of antioxidant machinery by 28-homobrassinolide in Brassica juncea L. under salt stress[J]. Advances in Applied Science Research，2015，6（4）：166-172.

[3]Egbichi I，Keyster M，Ludidi N. Effect of exogenous application of nitric oxide on salt stress responses of soybean[J]. South African Journal of Botany，2014，90（1）：131-136.

[4]劉友良，汪良駒. 植物對鹽脅迫的反應和耐鹽性[M]//余叔文，湯章城. 植物生理與分子生物學. 2版.北京：科學出版社，1998：752-754.

[5]劉愛榮，張遠兵，陳登科. 鹽脅迫對鹽芥（Thellungiella halophila）生長和抗氧化酶活性的影響[J]. 植物研究，2006，26（2）：216-221.

[6]Costa P，Neto A，Bezerra M，et al. Antioxidant-enzymatic system of two sorghum genotypes differing in salt tolerance[J]. Brazilian Journal of Plant Physiology，2005，17（4）：353-362.endprint

[7]Hernández J A，Ferrer M A，Jiménez A，et al. Antioxidant systems and O-2[KG-*2]· / H2O2 production in the apoplast of pea leaves. Its relation with salt-induced necrotic lesions in minor veins[J]. Plant Physiology，2001，127（3）：817-831.

[8]高永生，陳集雙. 鹽脅迫下鑭對小麥幼苗葉片抗氧化系統活性的影響[J]. 中國稀土學報，2005，23（4）：490-495.

[9]Anderson B E，Ward J M，Schroeder J I. Evidence for an extracellular reception site for abscisic acid in commelina guard cells[J]. Plant Physiology，1994，104（4）：1177-1183.

[10] 苗雨晨，董發才，宋純鵬. 過氧化——植物體內的一種信號分子[J]. 生物學雜志，2001，18（2）：4-6.

[11]趙鳳云，王元秀. 植物體內重要的信號分子——H2O2[J]. 西北植物學報，2006，26（2）：427-434.

[12]李師翁，薛林貴，馮虎元，等. 植物中的H2O2信號及其功能[J]. 中國生物化學與分子生物學報，2007，23（10）：804-810.

[13]Wahid A，Perveen M，Gelani S，et al. Pretreatment of seed with H2O2 improves salt tolerance of wheat seedlings by alleviation of oxidative damage and expression of stress proteins[J]. Journal of Plant Physiology，2007，164（3）：283-294.

[14]Chung J S，Zhu J K，Bressan R A，et al. Reactive oxygen species mediate Na+-induced SOS1 mRNA stability in Arabidopsis[J]. Plant Journal for Cell and Molecular Biology，2008，53（3）：554-565.

[15]劉遵春，陳榮江，包東娥. 干旱脅迫對金光杏梅幼苗生長及其生理生化指標的影響[J]. 沈陽農業大學學報，2008，39（1）：100-103.

[16]Li D H，Liu H，Yang Y L，et al. Down-regulated expression of gene by RNA interference enhances drought tolerance in rice[J]. Rice Science，2008，16（1）：14-20.

[17]張立軍，魏 穎，宋廣周，等. H2O2信號在植物理化脅迫反應中的作用[J]. 遼寧農業科學，2008（2）：33-37.

[18]Gong M，Chen B，Li Z G，et al. Heat-shock-induced cross adaptation to heat，chilling，drought and salt stress in maize seedlings and involvement of H2O2[J]. Journal of Plant Physiology，2001，158（9）：1125-1130.

[19]毛桂蓮，許 興，米海莉，等. NaCl脅迫下枸杞愈傷組織活性氧產生與質膜H+/Na+酶活性的關系[J]. 干旱地區農業研究，2003，21（3）：110-113.

[20]Liu A R. Effects of salt stress on the growth and the antioxidant enzyme activity of Thellungiella halophila[J]. Bulletin of Botanical Research，2006，26（2）：216-221.

[21]王國驕，唐 亮，范淑秀，等. 抗氧化機制在作物對非生物脅迫耐性中的作用[J]. 沈陽農業大學學報，2012，43（6）：719-724.

[22]孫衛紅，王偉青，孟慶偉. 植物抗壞血酸過氧化物酶的作用機制、酶學及分子特性[J]. 植物生理學報，2005，41（2）：143-147.

[23]蔡妙珍，羅安程，林咸永，等. Ca2+對過量Fe2+脅迫下水稻保護酶活性及膜脂過氧化的影響[J]. 作物學報，2003，29（3）：447-451.

[24]梁國慶，孫靜文，周 衛，等. 鈣對蘋果果實超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性及其基因表達的影響[J]. 植物營養與肥料學報，2011，17（2）：438-444.

[25]蔣景龍. H2O2與生長素對山黧豆初生根發育的影響[J]. 江蘇農業科學，2016，44（3）：121-123.

[26]蔡鳳香，陳豆豆，楊 飛，等. H2O2對水稻幼苗生長和生理的調節[J]. 江蘇農業科學，2016，44（3）：74-77.

[27]Beligni M V，Lamattina L. Nitric oxide interferes with plant photo-oxidative stress by detoxifying reactive oxygen species[J]. Plant Cell & Environment，2002，25（6）：737-748.

[28]Lee S C，Kang B G，Oh S E. Induction of ascorbate peroxidase by ethylene and hydrogen peroxide during growth of cultured soybean cells[J]. Molecules and Cells，1999，9（2）：166-171.

[29]Morita S，Masumura T，Tanaka K，et al. Induction of rice cytosolic ascorbate peroxidase mRNA by oxidative stress； the involvement of hydrogen peroxide in oxidative stress signalling[J]. Plant & Cell Physiology，1999，40（4）：417-422.

[30]Zhang A，Jiang M，Zhang J，et al. Nitric oxide induced by hydrogen peroxide mediates abscisic acid-induced activation of the mitogen-activated protein kinase cascade involved in antioxidant defense in maize leaves[J]. New Phytologist，2007，175（1）：36-50.endprint