黃粉蟲蟲粉對球孢白僵菌孢子粉產量、質量及其毒力的影響

陶淑霞+薛丹+肖悅+田徑

摘要： 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）在營養貧乏的培養基質上，菌株易發生退化，為保持高毒力優良菌株的穩定性，采用固液雙相法生產球孢白僵菌分生孢子粉，在大米固態培養基中加入不同劑量的黃粉蟲蟲粉，研究添加蟲粉對孢子粉產量、質量及其對大豆食心蟲（Leguminivora glycinivorella）毒力的影響。結果表明，添加蟲粉對球孢白僵菌的產粉量具有明顯的促進作用，其中5.0+處理組的產粉量達到46.88 mg/g；添加蟲粉對孢子粉活孢率無顯著影響，但各處理組間的萌發速率不同，其中5.0+處理組的孢子萌發率達到50%、90%所需的時間分別為13.86、20.77 h，明顯短于對照組。5.0+處理組的孢子粉對大豆食心蟲毒力最高，接種后第10天的校正死亡率達到98.27%，侵染率為96.67%，致死中時（lethal time of 50%，簡稱LT50）為5.58 d。說明添加蟲粉可以明顯提高大米固態發酵生產球孢白僵菌的孢子粉產量和質量，有利于保持高毒力優良菌株的穩定性。

關鍵詞： 球孢白僵菌；黃粉蟲蟲粉；孢子粉；毒力；大豆食心蟲；微生物防治

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0114-03

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）作為一種重要的生物防治介體，由于它對環境無污染、對人和動物無毒害、殺蟲譜廣、致病性強，從而成為目前國內外應用最廣泛的昆蟲病原真菌。球孢白僵菌是害蟲微生物防治中的一種經典絲孢類昆蟲病原真菌，可侵染15個目149個科的700多種昆蟲和若干種螨類。在自然界中，它具有分布范圍廣、感染力強、易于擴散流行的特點，因此被認為是具有開發潛力的生防真菌 。

隨著球孢白僵菌的產業化發展，人們對高質量、高純度球孢白僵菌分生孢子的需求量越來越大。生產上面臨著由菌株退化而導致的防效不穩、高毒力菌株多代移植后毒力退化的問題[3]。因此在實際生產中控制菌株退化是十分必要的。長期在營養貧乏的培養基質上培養球孢白僵菌容易導致菌株產生退化現象[4]。因此，根據目前球孢白僵菌生產和應用的現狀，亟待解決的問題之一是如何保持高毒力優良菌株的穩定性。

黃粉蟲是一種高蛋白、高脂肪、氨基酸含量較全面的資源昆蟲。本試驗選用經毒力測定對大豆食心蟲具有高毒力的球孢白僵菌Bb02作為供試菌株，采用固液雙相法生產球孢白僵菌分生孢子粉，在大米固態培養基中加入不同劑量的黃粉蟲蟲粉，研究添加蟲粉對孢子粉含孢量、活孢率、孢子萌發速率及其對大豆食心蟲毒力的影響，以求證添加蟲粉對孢子粉質量、產量及對大豆食心蟲毒力的影響，為今后球孢白僵菌孢子粉的工業化生產提供必要參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗中所選用的球孢白僵菌為分離自大豆食心蟲越冬幼蟲且經過篩選對其具有高毒力的Bb02菌株。

1.2 供試昆蟲

大豆食心蟲采自吉林省長春市吉林農業大學植物保護基地大豆田，自然脫莢的越冬老熟幼蟲。選擇健康、整齊一致的幼蟲用于試驗。黃粉蟲由吉林農業大學昆蟲實驗室提供，取新鮮健康的黃粉蟲蛹，微波烘干，研磨成粉備用。

1.3 球孢白僵菌孢子粉生產

1.3.1 液體培養

采用固液雙相法生產球孢白僵菌分生孢子粉，應用SDY培養基（成分：葡萄糖為40 g，酵母浸出粉為10 g，蛋白胨為10 g，水為1 000 mL）進行母液和子液培養。將篩選出的高毒力菌株Bb02的孢子粉接入20 mL的SDY培養基中，在25 ℃，130 r/min搖床中培養48 h后，取1 mL母液加入到滅菌后的100 mL SDY培養基中，在25 ℃，130 r/min搖床中進行子液培養24 h。

1.3.2 固體培養

每個保鮮袋盛裝100 g大米，拌入0.5 mL豆油，分別添加蟲粉1.0、2.5、5.0 g，替代相應等量的大米，以不添加蟲粉為對照，各處理分別用1.0+、2.5+、5.0+、CK表示，每個處理重復3次。經濕熱滅菌至適當熟度，取子液接入其中并進行下一步培養，接種量為13%（體積/質量），充分混合后鋪平，將袋口邊折起。在溫度為25 ℃、相對濕度為75%的條件下培養14 d。將發酵物置于超凈工作臺上自然晾干后，用200目標準篩收集孢子粉。對收集的孢子粉進行質量檢測。

1.4 球孢白僵菌產粉量和孢子粉質量的測定

產粉量：每袋大米培養物上收獲的孢子粉質量除以大米質量即為產粉量（mg/g）。

含孢量：稱取孢子粉1 mg加入到50 mL 0.05%吐溫-80溶液中，經磁力攪拌器充分攪拌（500 r/min）后鏡檢單孢率為100%時，用血球計數板測定孢子懸浮液濃度（個/mL），計算1 g孢子粉所含的孢子個數，即為含孢量（個/g）。

含水量：將稱量瓶烘干稱質量，加入約100 mg孢子粉，將稱量瓶和孢子粉在100 ℃下干燥2 h后取出稱質量，計算含水量（%）。

活孢率：取適量孢子粉加入至50 mL SDY培養基中，配成濃度為1.0×106個/mL的孢子懸浮液，在25 ℃條件下，130 r/min培養24 h，鏡檢萌發率，即為孢子粉的活孢率（%）。孢子萌發的標準為芽管長度等于或大于孢子直徑[5]。

1.5 球孢白僵菌孢子萌發速率測定

分別取1.0+、2.5+、5.0+、CK組孢子粉適量，加入 50 mL SDY培養基中，配成濃度為1.0×106個/mL的孢子懸浮液，在25 ℃，130 r/min搖床中培養。分別在培養6、12、18、24、30 h時，用微量移液器吸取20 μL菌液滴在血球計數板上，然后置于顯微鏡下進行觀察，測定孢子的萌發率，每個處理重復3次。

1.6 球孢白僵菌芽生孢子濃度的測定

將上述用于測定孢子萌發率的菌液繼續培養至48 h時觀察芽生孢子，分別在培養48、72、96、168 h時，用微量移液器吸取20 μL 培養液，加入到380 μL無菌水中進行稀釋。然后用微量移液器吸取20 μL滴在血球計數板上，然后置于顯微鏡下進行觀察，測定芽生孢子濃度（個/mL），每個菌株3次重復。

1.7 球孢白僵菌孢子粉毒力測定

分別稱取各處理組孢子粉與滅菌土（過50目篩）充分混勻，使1 g菌土中含有1.0×107個分生孢子。將含水量為20%的滅菌土壤盛于塑料杯（8 cm×12 cm）中，然后在表面均勻灑上配制的菌土，每個杯子接入20頭健康的大豆食心蟲老熟幼蟲，使 之在菌土上自由爬行，待幼蟲鉆入土壤后，將杯口用保鮮膜封好，放于25 ℃培養箱中，每個處理重復3次，分別在接種后第4、6、8、10天調查幼蟲死亡情況，同時撿出死蟲將其保濕培養。觀察球孢白僵菌侵染情況，統計幼蟲死亡率、校正死亡率和侵染率，并計算致死中時（lethal time of 50%，簡稱LT50）。

1.8 數據分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析；單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗各蟲粉添加組孢子粉的產量、質量及其對大豆食心蟲毒力的差異顯著性（P<0.05）； 用回歸分析中曲線估計擬合孢子粉的萌發率隨培養時間變化的過程；用回歸分析中Probit分析各處理組孢子粉對大豆食心蟲的LT50。

2 結果與分析

2.1 添加蟲粉對球孢白僵菌孢子粉產量和質量的影響

由表1可知，各處理組間的球孢白僵菌產粉量具有顯著差異（F3，11=175.299，P<0.000 1），添加蟲粉對球孢白僵菌產粉量具有明顯的促進作用，其中5.0+組的球孢白僵菌產粉量高達46.88 mg/g，對照組的球孢白僵菌產粉量只有1862 mg/g。各處理組的含水量（F3，11=0.03，P=0.993）和含孢量（F3，11=0.277，P=0.841）均無顯著差異。蟲粉添加組[CM（25]的活孢率隨著蟲粉添加量的增加而增加，但未達到顯著差

異水平（F3，11=1.512，P=0.284）。

2.2 添加蟲粉對球孢白僵菌孢子萌發速率的影響

各處理組的球孢白僵菌孢子萌發率觀察值如圖1所示，添加組和對照組球孢白僵菌孢子粉在第24 h的萌發率差異并不顯著（F3，11=1.512，P=0.284）。用Logistic方程 A為最大觀測值的漸近值；B為常數；k為增長率）擬合球孢白僵菌孢子粉的萌發率（G）隨培養時間（t）變化的過程，擬合結果較好[6]。根據擬合模型計算球孢白僵菌孢子萌發率達到50%、90%所需的時間，5.0+組分別為13.86、20.77 h，2.5+組別為15.10、21.88 h，1.0+組分別為16.04、22.63 h，對照組分別為16.57、22.70 h。雖然添加組和對照組球孢白僵菌孢子粉的最終萌發率是一致的，但5.0+組的孢子萌發速度最快，對照組孢子的萌發速度最慢，表明添加蟲粉對球孢白僵菌孢子的萌發速率具有促進作用。

2.3 添加蟲粉對球孢白僵菌芽生孢子濃度的影響

由表2可知，培養48 h后5.0+組的球孢白僵菌芽生孢子濃度為 1.24×106個/mL，顯著高于其他組（F3，11=11.786，P=0.03），而2.5+、1.0+組與對照組差異不顯著。在培養72 h（F3，11=74.115，P<0.000 1）、96 h（F3，11=39.195，P<0.000 1）、168 h（F3，11=125.061，P<0.000 1）時，各處理組間球孢白僵菌芽生孢子濃度存在顯著差異，芽生孢子濃度隨著蟲粉添加量的增加呈現顯著的上升趨勢，表明添加蟲粉對Bb02菌株液體發酵芽生孢子濃度有明顯的促進作用。

2.4 添加蟲粉對球孢白僵菌孢子粉毒力的影響

由表3可知，與對照組相比，5.0+組的球孢白僵菌孢子粉對大豆食心蟲的校正死亡率（P=0.022）、侵染率（P=0046）有顯著影響。5.0+組對大豆食心蟲毒力最高，接種后第10天的校正死亡率達到98.27%，侵染率為96.67%，LT50為 5.58 d，而對照組接種后第10天的校正死亡率為9138%，侵染率為8833%，LT50為6.64 d，可見添加蟲粉能明顯提高球孢白僵菌對大豆食心蟲老熟幼蟲的毒力。

3 討論

蟲生真菌在繼代培養過程中會發生高頻率的退化現象，表現為菌落角變、氣生菌絲化、分生孢子產生能力下降或喪失、重要次生代謝產物合成能力下降或喪失，往往給蟲生真菌的工業化生產及應用帶來重大損失[7-8]。球孢白僵菌的高度變異可引起生產菌種的退化，從而導致毒力降低，嚴重影響防治效果。因此在生產和應用中，選育高毒力菌株的同時，應采取有效措施控制變異。在營養貧乏的培養基質上，球孢白僵菌菌株易發生變異，為保持高毒力優良菌株的穩定性，應選擇適宜的培養基質[9]。

王福祥等在培養球孢白僵菌的PDA培養基中加入黃粉蟲幼蟲發現，與對照相比，添加幼蟲的處理組在營養生長量、孢子萌發率、產孢量和酶活性等方面均有所提高[10]，但在培養基上的產孢狀況和應用中的規模化生產還存在著很大差異[11]，所以還不能充分反映生產中的實際產孢情況。因此，本試驗將黃粉蟲蟲粉添加到大米固態培養基中，采用固液雙相法對供試菌株進行適當規模的擴大生產。結果表明，添加蟲粉可以顯著提高大米固態發酵生產球孢白僵菌的孢子粉產量和質量，有利于保持高毒力優良菌株的穩定性。

目前，球孢白僵菌孢子粉的活孢率以24 h的萌發率表示[12]。然而，活孢率相同的孢子粉并不意味著其孢子的萌發進程一致[13]。本研究在培養基質中添加黃粉蟲蟲粉雖未影響球孢白僵菌孢子粉的活孢率，但與對照相比，球孢白僵菌孢子萌發率達到50%、90%所需的時間卻明顯縮短，表明添加黃粉蟲蟲粉可能影響球孢白僵菌孢子恢復活力的進程或吸水萌發的速度，與對照相比，對大豆食心蟲的毒力也有所增加，這種差異正好從孢子萌發速度差異的比較中得到合理解釋，即萌發速度越快的孢子毒力越強。由此印證，任何影響孢子萌發的因素都將影響到孢子毒力[14]。

穩定并提高蟲生真菌的毒力對發展有效的商品制劑至關重要。蟲生真菌入侵寄主的過程與其對體壁結構物質分解酶的活性有關，幾丁質酶和蛋白降解酶在蟲生真菌入侵寄主體壁的過程中起重要作用，其活性高低是決定真菌侵染能力的重要因素[15-16]。蟲生真菌的幾丁質酶和蛋白降解酶都具有誘導性。研究表明，不同的真菌培養基也影響真菌毒力。Milner發現，粉擬青霉菌株對麥長管蚜（Sitobion avenae）的毒力在蚜蟲或含蚜蟲表皮的瓊脂板上傳代3代后LT50從11.1 d下降到 5 d[17]。Pinto等發現，黃綠綠僵菌（Metarhizium flavoviride）蛋白降解酶的活性在該菌的培養液中存在，但當有昆蟲表皮存在時能高度表達[18]。本研究在培養基質中加入蟲粉顯著提高球孢白僵菌對大豆食心蟲的毒力，也進一步表明加入昆蟲物質可誘導蟲生真菌毒力的提高，說明毒力因子易受培養底物的誘導，為提高真菌毒力提供了有價值的途徑。

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