抗青枯病病菌植物殺菌劑的研究
2018-01-06 01:01:49曹鵬飛陳銀華周慧娟范芳娟楊繼
江蘇農業科學 2017年22期
曹鵬飛+陳銀華+周慧娟+范芳娟+楊繼
摘要： 為研究抗青枯病病原菌的植物殺菌劑，以8種植物為材料，從中篩選出抑菌效果較好的有效植物，并采用單因素和二次正交旋轉組合試驗對其最適乳油配方及其穩定性進行研究。結果表明，銀杏、馬尾松2種提取物的抑菌效果均顯著高于農用鏈霉素，其中馬尾松提取物的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達9.06 mm。植物提取物在丙酮中溶解效果好于其他溶劑，在吐溫-80中的分散最佳，且最穩定。有效植物提取物的最適乳油配方為：506 mg/mL水杉提取物，827 mg/mL馬尾松提取物，481 mg/mL銀杏提取物，409 mg/mL野艾蒿提取物，0.205 mL/mL溶劑的乳化劑。該試驗結果可為植物源殺菌劑的綜合開發利用提供理論依據。
關鍵詞： 青枯病；植物源殺菌劑；二次正交旋轉組合試驗；植物源殺菌劑
中圖分類號： S482.2+92 文獻標志碼： A
文章編號：1002-1302（2017）22-0102-06
青枯病是一種全世界范圍廣泛分布的細菌性土傳病害，在高溫、高濕的熱帶、亞熱帶地區大量流行，是農業可持續發展的主要障礙之一[1]。青枯病害往往發生在梅雨季節過后，造成植物連片死亡和大幅度減產，發病后期，治療比較困難，是一種系統侵染病害，如果土壤酸化嚴重、板結厲害，青枯病會大面積發生，甚至造成毀園。該病是由青枯假單胞桿菌[茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）]引起的[2]，通過根和莖的傷口或次生根的根冠進入植物體，侵染寄主的木質部，然后在整個維管束中蔓延，引起嚴重的萎蔫最終導致植物死亡[3]。青枯病菌在農作物中分布范圍廣，能侵染多達50個科200種作物，在番茄、辣椒、煙草等茄科作物中普遍發生。
近年來，青枯病的防治主要以化學藥劑為主，如琥珀酸銅、青枯靈和噻菌銅等。但防治青枯病主要以推遲發病高峰期、減輕發病程度為目的，尤其在大面積發病時才進行用藥防治已經基本沒有效果。此外，長期使用化學農藥易導致植株產生抗藥性，造成土壤惡化、生態平衡破壞、農藥殘留等問題，危害到人類身體健康，并且造成很大的經濟損失[4]。因此，尋求安全性高且不易產生抗藥性的殺菌劑，已受到廣泛關注。據相關研究表明，幾乎每種植物都能產生抑菌活性，但是抑菌效力和抑菌范圍還存在差異[5-7]，且研究表明銀杏[8]、大蒜[9]、黃花蒿[10]、紫莖澤蘭[11]等對青枯病菌有較好的抑制作用，因此研究開發安全生態的抗青枯病病原菌的植物源殺菌劑具有一定的可行性。
本研究以銀杏外種皮、樟樹枝葉、水杉枝葉、馬尾松針、八角金盤葉、冬青衛矛葉、龍葵根、野艾蒿等為植物材料，篩選出具有較強抗青枯病病原菌能力的有效植物，并對各植物提取物的最適抑菌濃度、最佳溶劑、最適乳化劑及其濃度進行優化，旨在制備出具有最佳抑菌效果的乳油劑型，旨在為植物源殺菌劑的綜合開發利用提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 試驗材料
櫻桃番茄青枯病病原菌，自行分離得到。
銀杏外種皮、樟樹（枝葉）、水杉（枝葉）、馬尾松針、八角金盤（葉）、冬青衛矛（葉）、龍葵（根）、野艾蒿（花序）等植物材料，采自浙江省麗水市蓮都區白云山、納愛斯廣場、麗水學院校園以及南明山等地。
1.1.2 主要試劑
吐溫-80、N，N-二甲基甲酰胺、吐溫-20、二乙醇胺、BY-130、農乳-600，以上試劑均為化學純。1%的纖維二糖、1%乳糖、1%麥芽糖、1%己六醇、1%甘露醇、1%山梨醇丙酮、苯、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、冰醋酸，以上試劑均為分析純。
1.1.3 培養基
TTC培養基[12]、牛肉膏蛋白胨培養基[13]、休和利夫森二氏培養基[14]、SPA培養基[15]、NA培養基[16]。
1.1.4 主要儀器
雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司，SW-CJ-2FD）、立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠，LDZX-75KB）、生物顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司，BA210）、生化培養箱（上海益恒實驗儀器有限公司，LRH-250）、723C可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司，Q/TBCR2）、智能恒溫搖床（太倉市實驗設備廠，DHZ-C）、旋轉蒸發儀（鞏義市英峪予華儀器廠，RE-52A）、SHZ-95型循環水式多用真空泵（河南鞏義市英峪予華儀器廠，1230211405）等。
1.2 試驗方法
1.2.1 植物樣品的采集與處理
隨機選取樣品植株（銀杏外種皮、樟樹枝葉、水杉枝葉、馬尾松針、八角金盤葉、冬青衛矛葉、龍葵根、野艾蒿花序）裝入塑封袋中，標上樣品序號、采樣地點等數據信息，帶回實驗室。將植物樣品洗凈，于 60 ℃ 烘干后粉碎過40目篩備用。
1.2.2 植物提取物的制備
取植物粉碎樣品，加入4倍體積的丙酮，置于避光陰涼處，140 r/min震蕩提取3次，每次振蕩時間為24 h，合并3次濾液后，旋轉減壓濃縮至膏狀物。
1.2.3 青枯病病原菌菌懸液的制備
將病原菌接種至SPA培養基中，于30 ℃條件下培養2 d后，將青枯病病原菌菌懸液稀釋至1.0×108個/mL備用。
1.2.4 植物提取物抑菌效果的測定
采用濾紙片法[17]測定植物提取物的抑菌效果。
1.2.5 抗青枯病病原菌植物提取物的篩選
將有效植物提取物稀釋至50 mg/mL，測定其抑菌圈直徑（mm），以篩選出具有抑菌作用的有效植物提取物。
1.2.6 抗青枯病病原菌有效植物提取物乳油配方的單因素試驗
1.2.6.1 植物提取物最適殺菌濃度的確定
用丙酮將有效植物提取物稀釋至25、50、100、200、400、800 mg/mL，篩選出最佳濃度。
1.2.6.2 溶劑的篩選
將4種有效植物提取物均等混合，取約10 mg點于凹形載玻片的凹面內，再用移液槍吸取50 μL的溶劑（丙酮、苯、乙醇、乙酸乙酯、甲醇）點于濃縮物的一側，加蓋玻片，觀察擴散速度；室溫靜置1 h后，觀察溶解情況。
1.2.6.3 乳化劑的篩選及其最適濃度的確定
將4種有效植物提取物均等混合，取100 mg植物提取物，2 mL丙酮，每種乳化劑（吐溫-20、吐溫-80、農乳-600、BY-130）設5個濃度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL），用溶劑溶解濃縮物后，配制成乳油，進行乳油分散情況和穩定性的觀察試驗，能迅速地自動分散為乳白色透明溶液，靜置后為均乳、無分離物，則為合格。
1.2.7 二次正交旋轉組合設計優化有效植物提取物最適乳油配方
在上述單因素試驗基礎上，以各有效植物提取物和乳化劑濃度為試驗因素，以抑菌圈大小為考察指標，采用二次正交旋轉組合試驗優化有效植物提取物的最適乳油配方，旨在制備出具有最佳抑菌效果的乳油劑型。
1.3 數據處理
所有數據分析均用DPS 9.50軟件完成。
2 結果與分析
2.1 抗青枯病病原菌有效植物提取物的篩選
方差分析結果表明，不同植物提取物的抑菌效果具有極顯著差異（F=12.561，P<0.01）。由圖1可知，銀杏、馬尾松提取物抑菌效果均顯著高于農用鏈霉素，其中馬尾松提取物抑菌效果最好，最大抑菌直徑為9.06 mm。水杉、野艾蒿提取物的抑菌效果明顯高于農用鏈霉素，但不顯著。香樟提取物則與農用鏈霉素抑菌效果相當。因此，選擇水杉、銀杏、馬尾松、野艾蒿這4種植物提取物作為乳油配方的有效提取物。
2.2 抗青枯病病原菌有效植物提取物乳油配方單因素試驗
2.2.1 有效植物提取物濃度對青枯病病原菌的抑菌效果
由圖2～圖5可知，在25～800 mg/mL濃度范圍內，4種植物提取物的抑菌效果隨其濃度的增加而逐漸增強。當水杉、馬尾松、銀杏提取物濃度在100～400 mg/mL時，其抑菌圈直徑均明顯增加。在800 mg/mL時，抑菌圈直徑均達到最大值，分別為1069、10.84、11.13 mm。野艾蒿提取物在50～400 mg/mL 濃度范圍內，抑菌圈直徑隨濃度的增加明顯增大，抑菌效果隨濃度升高呈明顯上升趨勢。在400～800 mg/mL濃度范圍內，抑菌圈直徑基本保持不變，抑菌效果趨于穩定，抑菌圈直徑在10.50 mm左右。
2.2.2 最佳溶劑、乳化劑的篩選及其最適濃度的確定
4種植物提取物混合后在6種溶劑 （丙酮、苯、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺）中的溶解度分別為0200、0.125、0、0.091、0.200、0.125 mg/μL，擴散速度大小依次為：丙酮>苯>甲醇>乙酸乙酯=乙醇>N，N-二甲基甲酰胺。這表明丙酮和乙醇均具有良好的溶解效果，但考慮到乙醇擴散速度不佳，故選用丙酮作為溶劑。
由表1可知，4種乳化劑在乳化過程均具有較好的穩定性，在放置1 h后均未出現分層現象。但就分散情況而言，4種乳化劑表現出不同的結果。吐溫-80的分散效果最佳，且當吐溫-80在0.20 mL/mL溶劑濃度下制備的乳油分散效果明顯優于其他乳化劑，乳油清亮無渾濁，長久放置不分層，故乳油配方選用吐溫-80為乳化劑。
2.3 二次正交旋轉組合設計優化有效植物提取物最適乳油配方
根據上述單因素試驗結果，以抑菌圈直徑大小為考察目標，以水杉提取物濃度（X1）、馬尾松提取物濃度（X2）、銀杏提取物濃度（X3）、野艾蒿提取物濃度（X4）、乳化劑濃度（X5）為考察因素，進行5因素5水平的二次正交旋轉試驗，以確定最適的乳油配方。試驗因素水平編碼如表2所示，試驗方案與結果如表3所示。
2.3.1 回歸模型建立與檢驗
采用DPS數據處理系統對表3中的結果進行二次多項式逐步回歸分析，得到水杉提取物、馬尾松提取物、銀杏提取物、野艾蒿提取物、乳化劑濃度的回 歸模型：Y=9.215 57+0.236 18X1+0.407 26X2-0.182 55X3- 0096 47X4+0.205 97X5+0.304 84X12-0.064 04X22+0165 21X32-0.117 73X42-0.165 60X52+0.355 70X1X2- 0251 77X1X3-0.123 33X1X4-0.106 92X1X5+0.164 73X2X3-0324 70X2X4+0.311 45X2X5-0.058 36X3X4-0.052 52X3X5+ 0010 42X4X5。
由表4可知，回歸方程的失擬性檢驗，F1=1.498 64
Y=9.215 57+0.236 18X1+0.407 26X2-0.182 55X3+0.205 97X5+0.304 84X12+0.165 21X32-0.165 60X52+0355 70X1X2-0.251 77X1X3-0.324 70X2X4+0311 45X2X5。
2.3.2 主效應分析
P值即概率，反映某一事件發生的可能性大小。各因素的P值可以反映出各因素對試驗指標的重要性，P值越小，表明該因素對試驗結果影響越大，即重要性越大。由表4可知，5個試驗因素對抑菌效果影響大小依次為馬尾松提取物濃度>水杉提取物濃度>乳化劑濃度>銀杏提取物濃度>野艾蒿提取物濃度。
2.3.3 單因子效應分析
當水杉提取物濃度、馬尾松提取物濃度、銀杏提取物濃度、野艾蒿提取物濃度、乳化劑濃度這5個影響因素中的任意4個為0，其中一個對抑菌效果的影響見圖6。由圖6可知，在-2.0～0水平下，水杉和銀杏提取物的抑菌效果隨濃度升高而下降，但在0～2.0水平時，卻隨濃度升高而升高，這可能是由于植物提取物間存在著抑制作用，在低濃度時，水杉和銀杏對其他植物的抑制較弱，體現了其他植物較好的抑菌效果，而到達0水平時，抑菌效果的下降則與水杉和銀杏與其他植物間的抑制作用逐漸增強直接相關。到達高水平時，抑菌效果又明顯增加，表明銀杏和水杉提取物的抑菌效果強于植物間的抑制作用。
在-2.0～0水平下，馬尾松提取物和乳化劑濃度的升高均可以增加抑菌效果，但在0～2.0水平時，再增加乳化劑濃度卻使抑菌效果略微下降，這可能是乳化劑濃度過高導致植物提取 物不能充分溶解；而抑菌效果隨馬尾松提取物濃度的增加呈線性上升趨勢，表明馬尾松提取物濃度對抑菌效果的影響明顯。野艾蒿提取物濃度的改變對抑菌效果的影響不明顯。
2.3.4 雙因子效應分析
從交互項系數可以看出，馬尾松與水杉提取物、馬尾松提取物與乳化劑以及馬尾松與野艾蒿提取物3種組分的交互作用達到極顯著水平；水杉與銀杏提取物的交互作用達到顯著水平，表明4種組分之間的配比對抑菌作用有顯著影響，響應面結果如圖7至圖10所示。
在水杉提取物濃度較低時，馬尾松提取物濃度的增加對抑菌效果的影響不明顯，而當濃度增大到0～2.0水平時，馬尾松提取物濃度的改變對抑菌效果的影響明顯。在馬尾松提取物為低濃度水平時，水杉濃度在-2.0～0.5水平時，抑菌直徑呈下降趨勢，在1.0～2.0水平，則有所上升。可見在 -0.5～1.0水平下的水杉與其他植物間具有較強的抑制作用，在低于這個濃度時，其他植物的抑菌效果顯然強于水杉的抑制作用，而高濃度的水杉提取物則對抑菌效果影響明顯。
當乳化劑濃度處于較低水平時，馬尾松提取物濃度的增加對抑菌效果的影響不明顯，可能是馬尾松提取物并未能全部溶于溶劑中，但在高濃度的乳化劑下，隨著馬尾松提取物濃度的增加抑菌效果明顯；而馬尾松提取物濃度較低時，乳化劑濃度的增加可使馬尾松提取物濃度下降導致抑菌效果減弱。
在水杉提取物濃度最低和銀杏提取物濃度最高以及銀杏提取物濃度最低和水杉提取物濃度最高時，抑菌直徑達到最大。而在銀杏和水杉濃度都為最高時，抑菌直徑卻較小，可見這2種植物間存在抑制作用。
在馬尾松提取物濃度為-2.0水平時，隨野艾蒿提取物濃度的增加抑菌效果呈上升趨勢；當野艾蒿濃度為-2.0水平時，隨著馬尾松提取物濃度增加抑菌效果逐漸加強。而在-2.0～1.5水平時，隨著兩者濃度等量增大時抑菌效果也逐漸增大，兩者都處于2.0水平時，抑菌效果卻下降，可見兩者存在相互促進作用，而高濃度提取物的抑菌效果的下降可能與提取物不能充分溶解有關。
2.3.5 有效植物提取物最適乳油配方尋優及驗證
對不同設計水平下的組合進行模擬試驗，從55=3 125個組合中，獲得抑菌直徑>9.30 mm的方案1 940個。根據頻次分析結果和實際情況取任一值即可得出優化組合，現取中值可得出，各組分的優化組合為水杉提取物濃度506 mg/mL，馬尾松提取物濃度827 mg/mL，銀杏提取物濃度481 mg/mL，野艾蒿提取物濃度 409 mg/mL，乳化劑濃度0.205 mL/mL溶劑，預測抑菌直徑為9.49 mm。經多次的驗證性試驗，該乳油配方的抑菌直徑為9.2 8 mm，與預測值無顯著差異（F=2177，P>0.05），說明該模型與試驗相吻合，能適用于生產實踐。
3 討論
3.1 抗青枯病病原菌植物提取物的篩選
相關研究表明，幾乎每種植物都能產生抑菌活性，但是抑菌效力和抑菌范圍存在著差異。冀玉良等研究發現，銀杏、大蒜、黃花蒿、紫莖澤蘭等植物對青枯病菌均有較好的抑制作用[8，10，18-19]。本試驗從銀杏、樟樹、水杉、馬尾松、八角金盤、冬青衛矛、龍葵、野艾蒿中篩選出銀杏、馬尾松、野艾蒿、水杉4種較農用鏈霉素具有明顯抑菌效果的植物，其中馬尾松的抑菌效果最強，這可能與其所含的萜類化學物質有關，如薄采穎等研究表明，松針葉二萜酸對番茄灰霉病菌也有明顯抑制作用[20]。由此表明，馬尾松提取物具有較強的抑菌作用，可作為新型植物源農藥重點開發的研究對象。
3.2 有效植物提取物乳油配方的優化
大量研究證明，二次正交旋轉組合試驗設計與傳統的單因子試驗法、正交試驗法相比，能根據預測值直接尋求最優區域，從多角度對模型進行模擬分析，以充分發掘模型所提供的信息[21-23]。故本試驗以各有效植物提取物、乳化劑濃度為試驗因素，采用二次正交旋轉組合試驗進行優化，得到最優乳油配方為： 水杉提取物506 mg/mL， 馬尾松提取物 827 mg/mL，
銀杏提取物481 mg/mL，野艾蒿提取物409 mg/mL，吐溫-80 0205 mL/mL溶劑，經驗證試驗后抑菌直徑與預測值 9.49 mm 無顯著差異。由單因子效應分析可知，馬尾松提取物濃度與抑菌效果的關系呈線性上升趨勢，較其他植物提取物對抑菌效果有極顯著影響。毛勝鳳等研究發現，馬尾松提取物在濃度為12.5～100.0 mg/mL時抑菌效果隨著濃度的增大而增大[24]。本試驗中馬尾松濃度在25～400 mg/mL范圍內，抑菌直徑呈線性上升趨勢，而濃度高于400 mg/mL后抑菌效果趨于平緩，表明在低濃度時馬尾松抑菌效果隨濃度增大而顯著增大，但高于一定水平時，馬尾松的抑菌效果則會趨于穩定，這可能與溶劑的溶解度大小有關。從雙因子互作效應分析可知，馬尾松提取物濃度較高時，隨著乳化劑濃度的增加抑菌效果明顯增加，研究表明天然的植物源殺菌劑在作用于寄主時，其滲透性、延展性都是有限的，須添加助劑使其充分發揮藥效[25-26]。本試驗研究表明，吐溫-80乳化劑的添加能增加有效植物提取物的滲透性和延展性，可達到增效的作用。在乳油劑型中，溶劑是其加工和使用中不可或缺的重要組分，用于溶解和稀釋原藥協助乳化分散，增加乳油流動性[27-28]。根據蔡亞東的研究表明，龍葵素乳油具較好擴散性和溶解度的溶劑為N，N-二甲基甲酰胺和二甲苯，而丙酮則相對效果較差[29]。本試驗通過對溶劑的擴散情況和溶解度的測定，確定丙酮為有效植物提取物乳油的最佳溶劑。由此可見，溶劑的選擇具有針對性。
綜上所述，經二次正交旋轉組合試驗優化得到植物提取物的最適乳油配方，抑菌效果顯著優于農用鏈霉素。但該乳油配方仍存在著不少問題，如植物活性成分難分離、易分解的問題還有待解決，乳油劑型的穩定性還有待進一步研究。
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