多抗霉素與丁子香酚混配對草莓灰霉病的防治效果

吳祥+吉沐祥+郭玉人+成瑋+楊敬輝+肖婷+王莉莉+邵春

摘要： 為篩選防治草莓灰霉病的新型生物混配殺菌劑，降低有效用藥量，提高防治效果，減少與替換對草莓灰霉病產生抗藥性的一些常用化學藥劑，采用室內菌絲生長速率抑制法測定多抗霉素、丁子香酚以及兩者混配等5個組合對草莓灰霉病病菌菌絲生長的抑菌活性。結果表明，2種藥劑及混配組合對草莓灰霉病病菌具有抑菌活性，其中多抗霉素與丁子香酚的質量比為5 ∶ 1時抑菌效果最好，EC50（ob）為5.528 6 μg/mL，增效系數為2.08，增效作用明顯。田間試驗結果表明，幾種藥劑處理對草莓灰霉病均有一定的防治效果，600、750 mL/hm2 6%多抗·丁香酚水乳劑在3次施藥7、14 d后均有較高的防效，其中，750 mL/hm2 6%多抗·丁香酚水乳劑優于各單劑與中、低濃度混配制劑的田間防效，而且對草莓安全無藥害。

關鍵詞： 多抗霉素；丁子香酚；草莓灰霉??；生物藥劑；田間防效

中圖分類號： S436.68+4 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0094-03

草莓（Fragaria ananassa Duchesne）是薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria）多年生草本植物[1]。草莓因其色澤鮮艷、營養價值高、風味濃郁、結果周期短、效益高而備受栽培者和消費者的青睞，被譽為“水果皇后”[2-3]。

草莓灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）侵染所致的低溫高濕型病害[4]。草莓灰霉病是影響我國草莓生產的一種常見的重要病害，主要危害草莓花器和果實，也危害葉片，危害主要發生在開花后，花器和果實染病后迅速腐爛。此病能迅速傳播，是造成草莓爛果的主要原因，一般使草莓減產10%～30%，嚴重時減產50%以上[5]。近幾年來，由于品種抗病性差、設施栽培規模擴大和長期連作等原因，草莓灰霉病的發生日趨嚴重[6-7]。為保證草莓的產量和品質，化學防治是目前應用最為普遍和廣泛的防治方法[8]?；瘜W防治雖然見效快，但使用不當易造成農藥殘留、環境污染等問題，已不能達到人們對環境保護和食品安全的要求[9-10]；此外，長期使用百菌清、多菌靈、腐霉利、嘧霉胺等常規殺菌劑進行化學防治，致使草莓灰霉病病菌對多種常規農藥產生抗藥性[11-12]。為提高防效，農戶往往加大用藥量，進行飽和式防治，更加劇灰霉病抗藥性的產生。生物防治具有低污染、低殘留和不易產生抗藥性等特點，因此，生物防治的研究就顯得尤為重要，同時也引起了國內外科技工作者的廣泛關注。

為了開發更安全有效的生物藥劑代替化學藥劑，針對生物源藥劑單一制劑防效不穩定和速效性差等問題，本研究應用生物源殺菌劑進行混配篩選。其中多抗霉素，又稱多氧霉素，是一種用現代生物工程技術生產的肽嘧啶核苷類農用抗生素，具有內吸性和治療作用及高度的靶標生物選擇性，屬于廣譜性抗生素類殺菌劑。丁子香酚是存在于桃金娘科丁子香屬植物丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.）中的一種有香味的揮發性物質，已有報道將丁子香酚研發作為蔬菜等作物的殺菌劑[13]。它具有殺菌譜廣、毒性低的特點，能迅速治療多種農作物、水果感染的真菌、細菌性病害，如灰葡萄孢菌、腐霉菌、鐮刀菌、雙疫霉菌等[14-17]。本研究將多抗霉素與丁子香酚混配進行室內抑菌活性測定，研制開發出6%多抗·丁子香酚水乳劑，并對草莓灰霉病進行田間防治試驗，試驗結果可為6%多抗·丁子香酚水乳劑的推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥劑

32%多抗霉素原藥，購自吉林省延邊春雷生物藥業有限公司；3%多抗霉素可濕性粉劑，購自山東魯抗生物農藥有限責任公司；20%丁子香酚水乳劑，購自江蘇劍牌農化股份有限公司；0.3%丁子香酚可溶液劑，購自江蘇南通神雨綠色藥業有限公司。

1.1.2 供試菌株

灰葡萄孢菌菌株，由江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所植保研究室從江蘇省句容市草莓田發病植株上分離出來，鑒定后保存于4 ℃馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）斜面上。

1.1.3 供試培養基

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基：200 g馬鈴薯，20 g蔗糖，15～20 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，pH值自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 室內抑菌活性試驗

1.2.1.1 藥液配制與濃度設計 把32%多抗霉素原藥和20%丁子香酚水乳劑分別配制成10 μg/mL的母液，置于4 ℃冰箱中備用；母液再用適量的無菌水溶解后，在單劑室內抑菌活性測定的基礎上，按多抗霉素與丁子香酚母液的質量比分別為20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 5進行配比，采用生長速率抑制法[18]測定混劑的抑制率。在初篩的基礎上，將多抗霉素、丁子香酚母液及5種混配組合均設置50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL 6個梯度的質量濃度。以藥劑有效成分在培養基中的濃度為測試濃度，配制成含藥PSA系列平皿。采用無菌水作空白對照（CK）。

1.2.1.2 測試方法 將保留的草莓灰霉病病菌轉接到PSA平皿中，在25 ℃活化72 h，然后在近菌落邊緣用打孔器制取直徑為5 mm的菌餅，并轉接到“1.2.1.1”節中配比稀釋配制的含藥PSA系列平皿和空白對照平皿中。每個處理重復4次。于25 ℃培養6 d，待對照中菌落約長至平皿直徑的4/5時，采用十字交叉法量取菌落直徑。菌絲生長平均抑制率計算公式如下：

1.2.1.3 混劑抑菌活性評價 以藥劑濃度對數值為自變量x、菌絲生長平均抑制率的概率值為因變量y，計算出毒力回歸方程和相關系數r，根據回歸方程求出各藥劑的EC50及95%置信區間。按Wadley的增效比率法[19]計算增效系數（SR）。根據增效系數評價藥劑混用的聯合作用類型，SR<0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用。SR的計算公式如下：

式中：EC50（th）為混劑EC50理論值；EC50（ob）為混劑EC50實測值；EC50A、EC50B分別為多抗霉素、丁子香酚單劑的EC50；a、b分別為多抗霉素、丁子香酚在混劑中的比例。

1.2.2 田間藥效試驗

1.2.2.1 試驗設計

試驗設3 000 mL/hm2 0.3%丁子香酚可溶液劑，3 000 g/hm2 3%多抗霉素可濕性粉劑，750、600、450 mL/hm2 6%多抗·丁子香酚水乳劑（以下分別簡稱高濃度、中濃度、低濃度）以及清水對照共6個處理。每個處理重復3次，每個小區20 m2，區組隨機排列。

1.2.2.2 試驗地概況

試驗在江蘇農博園6號草莓大棚內進行。草莓品種為“紅顏”，供試草莓于2015年9月12日移栽。試驗大棚土壤質地為黏壤土，肥力中等偏上，栽培管理采用當地常規管理方法，試驗期間草莓長勢均衡、良好。

1.2.2.3 施藥時間與方法

試驗分別于2015年11月26日、12月3日、12月10日用黃果樹16型背負式電動噴霧器采用葉面噴霧法進行3次施藥防治，用水量為900 kg/hm2，對草莓全株均勻噴霧。

1.2.2.4 調查方法

采用5點取樣法，每點調查20株，分別與2015年12月17、24日進行發病情況調查，并記錄總果數和病果數，計算防治效果。采用Duncans新復極差法進行統計分析。施藥后不定期觀察草莓的生長發育情況，以明確藥劑對草莓的安全性。

1.3 數據處理

采用DPS 13.0軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 室內抑菌活性測定結果

由表1可知，多抗霉素與丁子香酚單劑及復配劑的濃度對數與抑菌效果概率值的相關系數均大于0.95，說明防治效果概率值的變異有95%以上來自濃度對數的變異，表明用所得模型表達濃度對數與防治效果概率值的關系可行。多抗霉素、丁子香酚單劑對草莓灰霉病病菌的EC50（ob）分別為 11.091 9、14.115 5 μg/mL，說明多抗霉素對草莓灰霉病病菌菌絲生長的抑菌活性稍高于丁子香酚。多抗霉素與丁子香酚分別以質量比20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 5混配后對草莓灰霉病病菌菌絲生長的EC50（ob）分別為6.875 6、5.804 9、5.528 6、7.623 1、13.844 9 μg/mL，并且多抗霉素與丁子香酚分別以質量比20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1混配后對草莓灰霉病病菌的抑制作用均強于2個單劑；5種混配組合對草莓灰霉病病菌的增效系數分別為1.63、1.95、2.08、1.62、0.98。

根據增效系數聯合評價標準可知，多抗霉素與丁子香酚以質量比為1 ∶ 5混配時為相加作用，以質量比為20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1混配時均為增效作用，且以質量比為5 ∶ 1混配時增效作用最明顯，增效系數為208。因此，推薦多抗霉素與丁子香酚混配的最佳質量配比為5 ∶ 1。

2.2 田間防治效果

為了驗證6%多抗·丁子香酚水乳劑（按多抗霉素與丁子香酚質量比為5 ∶ 1配制加工而成）對草莓灰霉病的田間防治效果，在江蘇農博園6號草莓大棚內進行田間防治試驗。由表2可知， 第3次施藥7 d后， 6%多抗·丁子香酚水乳劑對草莓灰霉病的田間防效表現為高濃度﹥中濃度﹥低濃度，防效分別為94.28%、89.66%、83.37%，以高濃度6%多抗·丁子香酚水乳劑的防效最高，極顯著高于中濃度和低濃度（P<0.01），中濃度與低濃度兩者之間的防效差異極顯著（P<0.01）?；炫渲苿┡c單劑比較，高濃度6%多抗·丁子香酚水乳劑的田間防效極顯著高于3 000 mL/hm2 0.3%丁子香

酚可溶液劑和3 000 g/hm2 3%多抗霉素可濕性粉劑的防效（P<0.01），中濃度和低濃度混配制劑與3 000 mL/hm2 0.3%丁子香酚可溶液劑之間的防效差異均不顯著，但與 3 000 g/hm2 3%多抗霉素可濕性粉劑之間的防效差異均極顯著（P<0.01）；2個單劑之間比較，3 000 mL/hm2 0.3%丁子香酚可溶液劑的防效極顯著高于3 000 g/hm2 3%多抗霉素可濕性粉劑（P<0.01）。第3次施藥14 d后，6%多抗·丁子香酚水乳劑對草莓灰霉病的田間防效表現為高濃度﹥中濃度﹥低濃度，防效分別為89.81%、89.10%、75.96%，高濃度與中濃度之間的防效差異不顯著，但兩者均極顯著高于低濃度和各單劑的防效（P<0.01）；低濃度的防效極顯著低于 3 000 mL/hm2 0.3%丁子香酚可溶液劑的防效，但極顯著高于3 000 g/hm2 3%多抗霉素可濕性粉劑的防效（P<0.01）；2個單劑之間比較，3 000 mL/hm2 0.3%丁子香酚可溶液劑的防效極顯著高于3 000 g/hm2 3%多抗霉素可濕性粉劑的防效（P<0.01）。

2.3 草莓安全性調查

施藥后不定期觀察草莓的生長情況，各處理草莓植株生長發育正常，未見任何不良影響，表明藥劑的安全性較好。

3 結論與討論

草莓因其果實柔軟多汁、味道鮮美、營養豐富、生育期短、結果早、產量高，成為我國重要的特種經濟作物[20]。隨著草莓設施栽培面積的不斷擴大，再加上常年連作田塊病殘體帶菌多、偏施氮肥草莓生長旺盛、草莓開花結果期多為冬春嚴寒季節通風少棚內濕度大等因素，易導致灰霉病嚴重發生[21]。

草莓灰霉病的防治一直是草莓生產中的一個重要環節，藥劑防治是主要手段，種植者仍以化學藥劑為主，不但給果品安全和生態環境留下隱患，而且化學藥劑普遍存在產生抗藥性的風險，在連續多年單一使用某一種殺菌劑后，極易使病原菌產生抗藥性及交互抗性[22]。周明國等報道，在上海、句容、南京等地大棚種植的草莓上，灰霉病病菌對多菌靈已產生了嚴重的抗藥性，在多個地區使用多菌靈、甲基托布津防治草莓灰霉病已基本失效[23]。劉波等報道，草莓灰霉病病菌已對二甲酰亞胺類殺菌劑速克靈產生抗藥性[24]。紀明山等報道，苯并咪唑類殺菌劑與乙霉威的混劑防治灰霉病的效果下降[25]。苯氨基嘧啶類殺菌劑在我國使用的時間不長，但在2003年紀明山等就報道了灰霉病病菌對該類殺菌劑嘧霉胺的抗藥性[26]。 2006年張傳清等首次報道對具有多作用位點的非專化性殺菌劑百菌清已產生低抗性的灰霉病病菌[27]。目前，為了防止草莓灰霉病病菌抗藥性的產生和減少農藥殘留等問題，人們越來越重視生物防治在灰霉病防治中的重要作用[28]。

本研究采用室內毒力測定與田間試驗相結合的方法，測試了多抗霉素與丁子香酚混配劑對草莓灰霉病的防治效果。室內毒力測定結果表明，多抗霉素、丁子香酚單劑對草莓灰霉病菌的EC50（ob）分別為11.091 9、14.115 5 μg/mL，均有較好的抑菌活性。多抗霉素與丁子香酚以質量比為20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 5混配對草莓灰霉病病菌的聯合作用表現為增效或相加作用，其中以20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1混配時表現為增效作用，且以質量比為5 ∶ 1混配時增效作用最明顯，增效系數為2.08。對以5 ∶ 1配比加工成制劑的6%多抗·丁子香酚水乳劑進行田間防效試驗，結果表明，草莓灰霉病發病初期，600、750 mL/hm2 6%多抗·丁子香酚水乳劑第3次施藥7、14 d后，病果防效在89.10%～94.28%之間，防效較高，明顯優于450 mL/hm2 6%多抗·丁子香酚水乳劑和各單劑的防效，且持效期較長，安全性較好。因此，多抗霉素和丁子香酚混配防治草莓灰霉病病菌是可行的，具有較好的應用前景。值得注意的是，本試驗以草莓灰霉病在田間發病前預防為主，如果在灰霉病大面積暴發的情況下，則生物藥劑很難及時有效地控制住病情的發展，須要把化學藥劑和生物農藥混用或交替使用進行防治。

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