芒果BCH基因的克隆與表達

陳景鋒+趙志常+高愛平+黃建峰+羅睿雄+劉寬亮+張夢云

摘要： β-胡蘿卜素羥化酶（BCH）基因是催化玉米黃素合成的關鍵基因，玉米黃素在植物光保護過程中發揮著重要的作用。采用RACE方法從黃色的金煌芒果的果皮中克隆得到了1個BCH基因，該基因全長cDNA序列為 1 160 bp，開放閱讀框為888 bp，編碼295個氨基酸，分子質量為32.97 ku，分子等電點為9.51。利用生物信息學在線分析軟件對其組成成分、疏水性/親水性、二級結構、功能結構域以及三級結構進行預測和分析。通過系統發育分析發現，該基因編碼的蛋白與溫州蜜柑、柚子、大豆、草莓等具有較近的親緣關系。對不同芒果品種的BCH基因的表達進行分析發現，紅色的貴妃品種中表達量較高，而黃色的金煌品種中表達量較低。

關鍵詞： 芒果；β-胡蘿卜素羥化酶（BCH）基因；基因克隆；基因表達分析；親緣關系

中圖分類號： Q785；S667.701 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0024-03

β-胡蘿卜素羥化酶（β-carotene hydroxylase，BCH） 基因是催化玉米黃素合成的關鍵基因。目前，已經報道了從擬南芥、甜橙、南豐蜜橘、甜椒等[1-5]植物中克隆到了該基因。由于BCH在類胡蘿卜素生物合成中的關鍵作用，已成為植物類胡蘿卜素遺傳工程改良中的主要目的基因。芒果類胡蘿卜素生物合成途徑中的 BCH基因分離和鑒定研究國內外至今未見報道，BCH在芒果類胡蘿卜素生物合成途徑中具體作用和功能目前還不清楚。本研究中克隆并分析了芒果BCH基因，為進一步研究BCH在芒果果實著色上的調控功能奠定分子基礎，對揭示 BCH基因在芒果類胡蘿卜素合成及果色形成中的作用具有重要理論意義，為進一步創制高胡蘿卜素含量新種質資源、開展芒果類胡蘿卜素品質育種提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

分別用刀片切取桂七芒果完全成熟的綠果皮、金煌芒果完全成熟的黃色果皮、貴妃芒果完全成熟的紅色果皮，切碎放入采樣袋中液氮速凍后，立即放入-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 芒果果皮總RNA提取 采用植物RNA提取試劑盒提取芒果果皮總RNA，用DNase試劑盒進行基因組DNA消除，RNase-free無菌水溶解，采用SMARTerTM RACE Amplification Kit（Clontech）反轉錄合成cDNA。

1.2.2 PCR擴增反應 擴增條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃延伸7 min。 反應體系為25 μL，其中含10×PCR buffer（含Mg2+） 2.5 μL、25 ng DNA模板、20 μmol引物、1.0 U Taq DNA聚合酶、5.0 mmol dNTPs。

1.3 BCH基因全長cDNA序列的獲得

以合成的 cDNA 為模板，根據已知的BCH基因片段設計cDNA 3′-RACE和5′-RACE引物，進行3′和5′端的擴增。將目的基因片段回收、連接、轉化、鑒定及測序，并根據得到的cDNA 3′ 端和5′末端的序列結果拼接BCH的全長cDNA，設計特異引物，進行全長cDNA序列的擴增。

1.4 BCH基因生物信息學分析

根據BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）登錄的BCH蛋白序列進行氨基酸序列的同源性分析，用DNAMAN軟件進行序列多重比對，并繪制系統進化樹推斷其在進化過程中親緣關系。采用bioedit軟件對BCH蛋白中各個氨基酸的含量、親水/疏水性進行了分析。WoLFPSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）軟件進行定位預測，采用Swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）蛋白的三級結構預測。

1.5 表達分析

分別提取桂七、金煌、貴妃芒果果皮的RNA，反轉為cDNA 并采用Primer 5.0設計引物進行RT-PCR的擴增。RT-PCR分析采用的內參引物序列為：actin-F，5′-AATGG AACTGGAATGGTCAAGGC-3′；actin-R，5′-TGCCAGATCT TCTCCATGTCATCCCA-3′。目的基因擴增采用的引物為：BCH-F，5′ -CAGCATAGCCCATATAGCACTC-3′；BCH-R，5′-CAATGGAGCCGATATAAAACTAT-3′。PCR 產物在10%瓊脂糖凝膠上進行電泳，并采用Quantity One 軟件進行數據分析，作出相對表達量。

2 結果與分析

2.1 BCH基因的獲得

根據得到金煌芒果BCH基因的3′端和5′端序列信息進行拼接，最后得到BCH基因的全長cDNA序列。設計特異引物，進行全長cDNA序列擴增，將電泳條帶回收測序后得到BCH基因的cDNA全長序列，為1160 bp，分析發現開放閱讀框為 888 bp，編碼295個氨基酸序列。通過NCBI上已經登錄的擬南芥、柚子、大豆、葡萄的BCH蛋白序列進行了比對（圖1），發現克隆的基因為BCH基因。

2.2 部分生物信息學分析

采用bioedit軟件對芒果BCH蛋白中各個氨基酸的含量進行分析，結果發現，該蛋白丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）和纈氨酸（Val）的含量較高（圖2），用NCBI 上的CDD（conserved domain database，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）數據庫分析其氨基酸序列中可能有的蛋白功能結構域，結果表明該蛋白有1個典型的FA-hydroxylase superfamily（脂肪酸羥化酶超家族） 保守結構域（圖3）。對其蛋白二級結構進行預測，發現芒果BCH蛋白的二級結構以無規則卷曲和β-折疊為主，也具有少量的α-螺旋結構（圖4）。采用bioedit軟件的Kyte 和Doolittle 算法對BCH蛋白的親水性/疏水性（正值表示疏水性，負值表示親水性）進行分析，BCH蛋白所含的氨基酸主要介于2.4～-2.3之間（圖5），采用WoLFPSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）軟件對BCH蛋白進行定位預測，發現該基因定位在葉綠體中，采用Swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件對蛋白的三級結構進行預測，推導出該蛋白可能的三級結構構型（圖6）。采用DNAMAN軟件進行親緣關系聚類分析發現，芒果BCH蛋白與溫州蜜柑、柚子、大豆等植物的蛋白序列聚為一類（圖7）。endprint

2.3 BCH基因的RT-PCR分析

分別提取桂七、金煌、貴妃這3種不同著色品種芒果果皮的RNA，反轉錄為cDNA，通過上述RT-PCR分析的引物進行擴增，對擴增結果進行分析發現，該基因在紅色品種貴妃的果實中表達較多，綠色品種的桂七果皮中次之，而黃色品種的金煌果皮中相對表達較少（圖8），初步推斷BCH基因可能與紅色品種的貴妃果實中的類胡蘿卜素合成有密切的關系。

3 討論

BCH是玉米黃素生物合成的重要基因，基因編碼蛋白的結構特征決定其基因的功能和性質。通過對幾個物種的BCH蛋白的比對發現芒果BCH蛋白含有BCH蛋白家族相同的保守序列，即含有一個脂肪酸羥化酶超家族保守結構域，前人通過對擬南芥、玉米、水仙等研究發現，也含有相同的保守結構域，亞細胞定位發現該基因定位于葉綠體中[6]，這與本研究結果相一致。通過聚類分析表明，芒果BCH基因與柑橘類具有較近的親緣關系。對其表達分析發現，紅色的貴妃品種中表達量較高， 而黃色的金煌品種中表達量較低。孫化雨等對毛竹的根、幼莖、葉片、葉鞘、節等部分的表達分析發現，BCH基因主要在葉片中表達，而根中表達量較少[7]；對轉基因擬南芥分析發現，葉片中葉綠素、葉黃素、類胡蘿卜素等含量升高，表明在毛竹中BCH基因的過量表達促進了類胡蘿卜素向玉米黃素轉化，使其含量增加，抗脅迫能力增加[8-9]。本研究從金煌芒果果皮中克隆得到了1個BCH基因，對該基因在芒果中的功能研究還須要進一步通過轉基因驗證其功能及在對芒果果實色澤形成的作用機理，為深入理解芒果果實色澤形成多樣性的原因提供理論依據，并為生產中著色不良成因提供改善的技術支持。

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