17β-雌二醇誘導(dǎo)大鼠形成垂體泌乳素瘤的可行性及其成瘤機(jī)制

何樂，王紅云，高華，李艷博，曹磊

(1北京市神經(jīng)外科研究所，北京100050；2首都醫(yī)科大學(xué)；3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院)

17β-雌二醇誘導(dǎo)大鼠形成垂體泌乳素瘤的可行性及其成瘤機(jī)制

何樂1，王紅云1，高華1，李艷博2，曹磊3

(1北京市神經(jīng)外科研究所，北京100050；2首都醫(yī)科大學(xué)；3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院)

目的探討持續(xù)皮下給予17β-雌二醇建立大鼠垂體泌乳素瘤模型的可行性及作用機(jī)制。方法將20只雌性F344大鼠行雙側(cè)卵巢去勢(shì)，1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只、雌二醇組10只。雌二醇組皮下植入含有10 mg 17β-雌二醇的滲透壓泵6周制備垂體泌乳素腺瘤模型，MRI顯示成瘤率為100%。將雌二醇組10只成瘤大鼠隨機(jī)分為氟維司群組5只，肌注氟維司群(20 mg/kg)；模型組5只，肌注等量溶媒。處理2周結(jié)束時(shí)，留取血清標(biāo)本；采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清泌乳素水平；測(cè)量靶區(qū)組織標(biāo)本(模型組和氟維司群組均為包含腫瘤組織的垂體，正常對(duì)照組為垂體)體積并稱質(zhì)量；取靶區(qū)組織標(biāo)本，分別行HE染色、網(wǎng)狀纖維染色、泌乳素免疫熒光染色、透射電鏡觀察病理學(xué)變化；采用熒光定量PCR技術(shù)和Western blotting法檢測(cè)靶區(qū)組織雌激素受體R(ER α)、WIF-1、β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果模型組血清泌乳素水平均高于正常對(duì)照組及氟維司群組(P均<0.01)。模型組鞍區(qū)組織體積和質(zhì)量均高于正常對(duì)照組和氟維司群組(P均<0.01)。模型組：HE染色顯示，垂體細(xì)胞的“巢樣”排列結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞呈無序排列，胞質(zhì)呈嗜酸性；網(wǎng)狀纖維染色可見網(wǎng)狀纖維因腫瘤過度生長(zhǎng)致明顯斷裂破壞；免疫熒光顯示腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見大量泌乳素陽性顆粒分布；電鏡下顯示腫瘤組織內(nèi)有大量泌乳素型細(xì)胞，可見泌乳素細(xì)胞特異性的“錯(cuò)位胞吐”現(xiàn)象。氟維司群組上述病理變化均較模型組減輕。模型組ERα mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均較正常對(duì)照組降低、均較氟維司群組升高，WIF-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均較正常對(duì)照組及氟維司群組降低，β-catenin mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均較正常對(duì)照組及氟維司群組升高，組間比較P<0.05或<0.01。結(jié)論持續(xù)皮下給予17β-雌二醇6周能夠誘導(dǎo)F344大鼠形成垂體泌乳素瘤，成瘤率達(dá)100%；其成瘤機(jī)制可能為17β-雌二醇作用于ERα，誘導(dǎo)Wnt/β-catenin通路因子WIF-1表達(dá)下調(diào)、β-catenin表達(dá)上調(diào)。

垂體泌乳素瘤；17β-雌二醇；雌激素受體α；Wnt/β-catenin通路；大鼠

垂體泌乳素瘤是最常見的功能性垂體腺瘤，約占垂體腺瘤的40%[1]。垂體腺瘤的發(fā)病機(jī)制研究在體外主要依賴垂體瘤細(xì)胞系，如大鼠MMQ細(xì)胞系、GH3細(xì)胞系等；在體內(nèi)因人體試驗(yàn)涉及醫(yī)學(xué)倫理報(bào)批等問題無法直接進(jìn)行，需建立垂體瘤動(dòng)物模型，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為人體研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。有研究報(bào)道，多巴胺D2受體(D2R)、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤致病因子1(MEN1)等基因敲除小鼠可自發(fā)誘導(dǎo)泌乳素瘤的形成；但上述模型不穩(wěn)定，成瘤緩慢，且費(fèi)用較高[2～4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)期服用雌激素的變性人群泌乳素瘤發(fā)生率顯著高于普通人群[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體(ER)在人類泌乳素瘤的形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且Wnt通路可能參與了腫瘤形成[6]。2015年1月～2016年2月，我們采用17β-雌二醇誘導(dǎo)F344大鼠構(gòu)建垂體泌乳素瘤模型，現(xiàn)探討其成瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 4周齡雌性F344大鼠20只，體質(zhì)量(60±10)g，SPF級(jí)，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由進(jìn)食、飲水，光照時(shí)間12 h。主要試劑及儀器：滲透壓泵(Sigma aldrich)，氟維司群(單純雌激素受體拮抗劑)、17β-雌二醇(EDOM)，HE染色和網(wǎng)狀纖維染色試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)， 泌乳素ELISA試劑盒(RapidBio)，兔抗大鼠ERα、WIF-1、β-catenin抗體(Santa Cruz)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 20只大鼠行雙側(cè)卵巢去勢(shì)，1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只、雌二醇組10只。雌二醇組皮下植入含10 mg 17β-雌二醇的滲透壓泵，正常對(duì)照組皮下植入含有溶媒的滲透壓泵。模型制作過程中，每周進(jìn)行MRI檢查(7.0-T Bruker小動(dòng)物MRI)掃描監(jiān)測(cè)成瘤情況。采用T2-加權(quán)成像序列矢冠軸位掃描，具體序列參數(shù)：TR/TE 2 000/41 ms；矩陣240×320；掃描野30 mm×30 mm (矢狀位)，40 mm×30 mm (軸位)；層厚0.5 mm。造模6周時(shí)，MRI檢查結(jié)果顯示，雌二醇組均有垂體腫瘤形成，信號(hào)均勻，腫瘤向上壓迫中腦及間腦，提示17β-雌二醇成功誘導(dǎo)泌乳素瘤形成。將雌二醇組10只成瘤大鼠隨機(jī)分為模型組5只，僅給予溶媒(10%苯甲醇+20%乙醇+70%蓖麻油)肌注；氟維司群組5組，給予氟維司群20 mg/kg肌注；均連續(xù)給藥2周。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 三組給藥2周結(jié)束時(shí)，心臟采血，離心后獲取血清；斷頭處死動(dòng)物，迅速取出靶區(qū)組織標(biāo)本(模型組和氟維司群組均為包括腫瘤組織的垂體，正常對(duì)照組為垂體)。①血清泌乳素：采用ELISA法檢測(cè)血清泌乳素水平。②靶區(qū)組織質(zhì)量和體積：測(cè)量靶區(qū)組織體積并稱質(zhì)量。③病理學(xué)觀察：將三組組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后切片，分別行HE染色和網(wǎng)狀纖維染色，操作步驟參照試劑盒說明書，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照；泌乳素免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照；經(jīng)負(fù)染色后在透射電鏡下觀察組織超微結(jié)構(gòu)并拍照。④ ERα、WIF-1、β-catenin mRNA表達(dá)：取各組組織標(biāo)本，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)ERα、WIF-1、β-catenin mRNA表達(dá)。將正常對(duì)照組表達(dá)量設(shè)為1，計(jì)算ERα、WIF-1、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量。⑤ ERα、WIF-1、β-catenin蛋白表達(dá)：取各組組織標(biāo)本，采用Western blotting法檢測(cè)ERα、WIF-1、β-catenin蛋白表達(dá)。將正常對(duì)照組表達(dá)量設(shè)為1，計(jì)算ERα、WIF-1、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三組血清泌乳素水平比較 正常對(duì)照組、模型組、氟維司群組血清泌乳素水平分別為(62±8)、(1 226±93)、(412±57)ng/mL，模型組、氟維司群組均高于正常對(duì)照組，氟維司群組低于模型組，組間比較P均<0.01。

2.2 三組靶區(qū)組織質(zhì)量和體積比較 見表1。

表1 各組靶區(qū)組織體積和質(zhì)量比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.01，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

2.3 三組病理學(xué)變化 正常對(duì)照組：HE染色顯示垂體細(xì)胞呈“巢樣”排列；網(wǎng)狀纖維染色示組織網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)完整；免疫熒光顯示垂體中泌乳素陽性細(xì)胞散在分布；電鏡下可見泌乳素、黃體生成素等不同類型細(xì)胞散在分布。模型組：HE染色顯示垂體細(xì)胞的“巢樣”排列結(jié)構(gòu)消失，腫瘤細(xì)胞呈無序排列，胞質(zhì)嗜酸性；網(wǎng)狀纖維染色可見網(wǎng)狀纖維因腫瘤過度生長(zhǎng)致斷裂破壞；免疫熒光顯示腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見大量泌乳素陽性顆粒分布；電鏡下顯示腫瘤組織可見大量泌乳素細(xì)胞，其胞質(zhì)內(nèi)可見大量形態(tài)不規(guī)則、大小不均一、直徑100～900 nm的電子致密顆粒物，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體豐富，線粒體富集，可見泌乳素細(xì)胞特異性的“錯(cuò)位胞吐”現(xiàn)象。氟維司群組：HE染色顯示細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)減少；免疫熒光示泌乳素陽性細(xì)胞比例減少；電鏡下泌乳素細(xì)胞內(nèi)胞核皺縮，染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)內(nèi)泌乳素顆粒減少，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體空泡化明顯，呈非典型凋亡表現(xiàn)。

2.4 三組ERα、WIF-1、β-catenin mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見表2。

表2 三組ERα、WIF-1、β-catenin mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

垂體泌乳素瘤常用的模型有雌激素誘導(dǎo)垂體瘤模型、老年大鼠自發(fā)形成垂體瘤、多巴胺受體敲除誘導(dǎo)等[3]，其中雌激素誘導(dǎo)模型具有可重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)。雌激素是一種有絲分裂原，與細(xì)胞核內(nèi)ER結(jié)合后啟動(dòng)或修飾下游基因轉(zhuǎn)錄[7]，使泌乳素基因啟動(dòng)子甲基化水平顯著下降，促進(jìn)泌乳素基因表達(dá)[8,9]；此外，雌激素對(duì)下丘腦多巴胺能神經(jīng)元具有抑制作用。多巴胺是下丘腦釋放的泌乳素抑制因子，其分泌量降低可使垂體泌乳素細(xì)胞失去有效控制，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和瘤變[9,10]。雌激素可促進(jìn)垂體瘤轉(zhuǎn)化因子和TNF-α表達(dá)，二者在垂體瘤形成過程中發(fā)揮重要作用[11]。既往多通過腹腔注射人工合成的非甾體雌激素物質(zhì)己烯雌酚制備垂體泌乳素腺瘤模型[4]，成瘤時(shí)間至少需要8周。本研究采用持續(xù)皮下注射17β-雌二醇建模。17β-雌二醇是雌激素的生理活性形式，與天然雌激素的生物學(xué)活性更接近。結(jié)果顯示，給予17β-雌二醇刺激6周，腫瘤體積增大，質(zhì)量增加，血清泌乳素水平明顯升高，HE染色及免疫組化結(jié)果提示大量泌乳素細(xì)胞形成，網(wǎng)狀纖維染色顯示正常的纖維斷裂殘存，說明腫瘤形成，而非垂體增生。MRI檢查結(jié)果提示，17β-雌二醇誘導(dǎo)6周泌乳素瘤的成瘤率達(dá)100%，說明該方法可重復(fù)性好，成瘤率高，且成瘤時(shí)間較己烯雌酚縮短。本研究進(jìn)一步設(shè)立氟維司群組，通過給予單純ER拮抗劑氟維司群抑制ERα表達(dá)，結(jié)果顯示氟維司群可阻斷17β-雌二醇的促腫瘤生長(zhǎng)作用。

Wnt配體與Wnt受體結(jié)合后，抑制GSK-3，進(jìn)而抑制β-catenin磷酸化，導(dǎo)致β-catenin降解減少，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin水平升高，繼而轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)[12]。Wnt通路激活促進(jìn)下游與細(xì)胞分化、增殖相關(guān)的 cyclin D1、c-myc、PPAR、Tcf-1等基因表達(dá)[13]。Semba等[14]研究發(fā)現(xiàn)，50%的泌乳素腺瘤和57%的垂體腺瘤其細(xì)胞核內(nèi)均有β-catenin過度表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)Ki-67呈正相關(guān)。但是，雌激素誘導(dǎo)泌乳素瘤形成是否與Wnt/β-catenin通路有關(guān)尚不明確。本研究結(jié)果顯示，模型組β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平均較正常對(duì)照組顯著升高，給予氟維司群拮抗ER表達(dá)后β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)。有文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)細(xì)胞中ER-IP3K通路可以與Wnt/β-catenin通路通過GSK-3-β-catenin相互作用，因此在泌乳素細(xì)胞中17β-雌二醇可能通過ER-IP3K通路激活GSK-3-β-catenin通路，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[15]。Wnt/β-catenin通路可以被內(nèi)源性的抑制因子如WIF-1阻斷，WIF-1通過與Wnt結(jié)合可以阻斷Wnt與其配體結(jié)合，從而抑制細(xì)胞分化與增殖。有文獻(xiàn)報(bào)道，在人類垂體瘤中WIF-1表達(dá)水平下調(diào)和細(xì)胞核內(nèi)β-catenin富集相關(guān)，且在垂體瘤細(xì)胞系GH3中轉(zhuǎn)染W(wǎng)IF-1可抑制細(xì)胞增殖[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組ERα mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組降低、較氟維司群組升高，WIF-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均較正常對(duì)照組及氟維司群組降低，β-catenin mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均較正常對(duì)照組及氟維司群組升高，提示17β-雌二醇可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)泌乳素瘤發(fā)生的作用。

綜上所述，持續(xù)皮下給予17β-雌二醇6周能夠誘導(dǎo)F344大鼠形成垂體泌乳素瘤，成瘤率達(dá)100%；其成瘤機(jī)制可能為17β-雌二醇作用于ERα，誘導(dǎo)Wnt/β-catenin通路WIF-1表達(dá)下調(diào)、β-catenin表達(dá)上調(diào)。

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國(guó)家衛(wèi)生行業(yè)公益性科研專項(xiàng)(201402008)；首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)-臨床合作基金資助項(xiàng)目(2016JL16)。

曹磊(E-mail： caolei_163@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.013

R736.4

A

1002-266X(2017)48-0043-03

2017-02-16)