乙醇灌胃對兔股骨頭內骨內壓和骨小梁結構的影響

李宏宇，席立成，趙子星，黃思城

(廣西壯族自治區人民醫院，南寧530021)

乙醇灌胃對兔股骨頭內骨內壓和骨小梁結構的影響

李宏宇，席立成，趙子星，黃思城

(廣西壯族自治區人民醫院，南寧530021)

目的探討乙醇灌胃對兔股骨頭內骨內壓及骨小梁結構的影響。方法將48只成年雄性新西蘭大白兔隨機分為觀察組和對照組，每組24只。觀察組給予42%乙醇灌胃，對照組給予生理鹽水灌胃，劑量均為10 mL/(kg·d)，3次/周，連續灌胃6個月。分別于灌胃前及灌胃1、3、6 個月時檢測兩組左后肢股骨頭內骨內壓；處死家兔，取其右后肢股骨頭組織，石蠟包埋，4 μm厚切片，HE染色，顯微鏡下觀察，計算骨小梁面積分數及空骨陷窩率。結果兩組干預前及灌胃1個月時，股骨頭內骨內壓、骨小梁面積分數及空骨陷窩率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；灌胃3、6個月時，觀察組股骨頭內骨內壓、空骨陷窩率均高于對照組，骨小梁面積分數均低于對照組，組間比較P<0.05或<0.01。結論長時間(≥3個月)乙醇灌胃可使兔股骨頭內骨內壓升高，骨小梁結構改變。

酒精性股骨頭壞死；骨內壓；骨小梁；空骨陷窩；乙醇；兔

長期大量飲酒可使股骨頭內骨微環境發生病理性改變，如骨內壓增加、血流灌注減少，導致酒精性股骨頭壞死[1]。骨內壓力增加時，骨內靜脈血淤滯加重，股骨頭內血流量顯著減少；當壓力超過平均動脈壓，可引起股骨頭進行性缺血，進而發生壞死[2,3]。大量飲酒或局部注射乙醇可顯著降低股骨頭內骨組織的礦物質密度，降低骨小梁對抗來自不同方向的應力，最終發生骨壞死或塌陷[4,5]。目前關于乙醇灌胃對股骨頭內骨內壓、骨小梁結構及空骨陷窩的影響鮮有報道。2015年12月～2016年12月，我們探討乙醇灌胃對家兔股骨頭內骨內壓及骨小梁結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性新西蘭種家兔48只，體質量(2.7±0.5)kg，購自廣西醫科大學實驗動物中心，許可證編號：SCXK桂2015-0002。電子分析天平(日本Sartortcl公司)，光學顯微鏡(BH-2型，日本Olympus公司)，BL-420生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)，穿刺針(16#，上海埃斯埃醫械塑料制品有限公司)，Image Pro Plus圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)。

1.2 動物分組及干預 將家兔隨機分為觀察組和對照組，每組24只。觀察組給予42%乙醇灌胃，對照組給予生理鹽水灌胃，劑量均為10 mL/(kg·d)，3次/周，連續灌胃6個月。

1.3 股骨頭內骨內壓檢測 分別于灌胃前及灌胃第 1、3、6 個月時檢測兩組(每個月取8只)左后肢股骨頭內骨內壓。具體方法：家兔經3%戊巴比妥鈉(25 mg/kg)靜脈麻醉，在左后肢股骨頭第3轉子上方作一個2 mm縱行小切口，分離肌肉顯露股骨外側粗隆，將穿刺測壓針旋轉插入股骨頭頭頸下部骨松質骨髓中；抽出針芯，滴入含2 500 U/mL肝素的生理鹽水；立刻連接生物功能實驗系統，穿刺針、測壓裝置與實驗動物心臟保持在一個水平面上，先通過三通開關向穿刺針內注入肝素生理鹽水0.5 mL，使之充滿后旋轉三通開關，使骨髓腔、穿刺針與壓力換能器完全相通；打開記錄系統，記錄壓力數據和曲線，連續測量15～30 min，以壓力平衡后的均值作為該部位骨內壓。

1.4 骨小梁結構觀察 將灌胃1、3、6個月時完成股骨頭內骨內壓檢測的家兔分別處死，取其右后肢股骨頭標本沿冠狀面剖開，生理鹽水沖洗，迅速置入10%甲醛中固定24～48 h，EDTA脫鈣，流水沖洗，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后4 μm厚連續切片，HE染色，封片后光學顯微鏡下觀察，計算骨小梁面積分數及空骨陷窩率。具體方法：①骨小梁面積分數：參照Lane-Sandhu法將股骨頭組織連續切片，選取每個標本中無明顯組織分離、相同深度的5張切片進行分析。在放大40倍條件下每張切片隨機選取5個視野，通過計算機圖像分析軟件計算各視野內骨小梁面積分數，取平均值。②空骨陷窩率：隨機對所觀察標本選5個高倍(×200)視野，在每個視野中任意計數50個骨陷窩以及其中空缺的骨陷窩個數，計算空骨陷窩占骨陷窩的百分比，即空骨陷窩率。

2 結果

灌胃前及灌胃1個月時，兩組光鏡下骨小梁完整，排列規則，形態無差別。灌胃3個月時，觀察組骨小梁變稀疏，空骨陷窩數增多；對照組無顯著變化。灌胃6個月時，觀察組骨小梁顯著稀疏、排列紊亂，空骨陷窩數顯著增多；對照組無顯著變化。

灌胃前及灌胃1個月時，兩組股骨頭內骨內壓、骨小梁面積分數及空骨陷窩率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；灌胃3、6個月時，觀察組股骨頭內骨內壓、空骨陷窩率均高于對照組，骨小梁面積分數均低于對照組，組間比較P<0.05或<0.01；且觀察組灌胃前及灌胃1、3、6 個月時骨內壓、空骨陷窩率逐漸升高，骨小梁面積分數逐漸降低，各時間點比較P均<0.05。見表1。

表1 兩組各時間點股骨頭內骨內壓、骨小梁面積分數及空骨陷窩率比較

注：與對照組同時間點比較，△P<0.05，#P<0.01；與同組灌胃前比較，▲P<0.05；與同組灌胃1個月比較，*P<0.05；與同組灌胃3個月比較，□P<0.05。

3 討論

骨內壓是指骨內血流在骨質間隙內或骨腔內所產生的壓力。目前，長期飲酒致股骨頭內骨內壓升高的機制尚不明確。有研究報道，乙醇的毒性作用可使脂肪細胞肥大、增生并融合成脂肪滴[6,7]。當股骨頭髓內脂肪細胞肥大、增生時，髓內有限空間縮小，引起骨細胞的“占位性病變”，壓迫小靜脈，使髓內靜脈血回流受阻；股骨頭是一個堅硬且不能膨脹的有限骨腔室，根據Starling原理，靜脈血回流一旦受阻，則靜脈壓升高并同時引起骨內壓明顯升高；骨內壓升高又進一步阻滯靜脈血回流，形成惡性循環[8]。骨內壓學說認為，股骨頭內骨內壓升高是股骨頭壞死的早期病理變化，骨內壓增加、血流灌注減少是發生股骨頭壞死的主要原因之一[1]。正常髖關節骨內壓約為5.37 kPa，當壓力超過26.75 kPa時極易發生股骨頭缺血性壞死。骨內壓升高可壓閉骨內小靜脈、竇狀隙及毛細血管，使股骨頭內血流量顯著減少[2,3]；當壓力超過平均動脈壓時，將引起股骨頭進行性缺血，最終導致股骨頭壞死。本研究乙醇灌胃1個月時兩組股骨頭內骨內壓無顯著變化，但灌胃3個月及6個月時，觀察組股骨頭內骨內壓高于對照組。提示長時間(≥3個月)大量飲酒可顯著升高股骨頭內骨內壓。

股骨頭內松質骨由交織排列的骨小梁構成，骨小梁力學強度與礦物質含量及其空間構型構成了股骨頭內部骨組織承重的主要生物力學結構[9]。應用乙醇灌胃模擬人類飲酒來研究乙醇對股骨頭微環境結構影響的方法已經得到廣泛應用[10～12]。本研究結果證實，短時間飲酒對股骨頭內骨小梁結構影響不大，但長期飲酒可使股骨頭內骨小梁結構發生紊亂，骨小梁面積減少。并且，隨著乙醇灌胃時間的延長，骨小梁結構呈進行性紊亂，斷裂程度逐漸增加。這可能與長期飲酒降低骨髓間充質干細胞活性，使成骨細胞活性下降、破骨細胞活性增強，導致骨細胞壞死[13～15]。多數骨小梁組織呈拱形結構，股骨頭之所以能承受很高的載荷與骨小梁構成的拱形結構關系密切[6]。當成骨細胞和骨細胞出現持續性壞死，股骨頭骨小梁的拱形結構發生改變，壞死骨質的吸收使骨小梁的力學強度下降，而持續的應力作用阻礙壞死后骨組織修復，使骨小梁面積減少，最終導致股骨頭壞死、塌陷[4,9]。

骨陷窩是指骨細胞的細胞體與礦化基質之間的空隙。骨陷窩組成的骨陷窩-微管系統不僅是骨內微環境的重要組成部分，而且在調節骨內微環境穩定、維持正常生理功能以及介導股骨頭壞死的發生、發展和修復等方面均發揮重要作用。空骨陷窩數增多是早期股骨頭壞死的重要病理改變，空骨陷窩率是空骨陷窩數與骨陷窩數的比值，是臨床病理診斷骨壞死的重要依據[16,17]。本研究結果顯示，乙醇灌胃1個月時，兩組空骨陷窩率比較差異無統計學意義，而灌胃3、6個月時，觀察組空骨陷窩數及空骨陷窩率顯著高于對照組。提示短時間攝入乙醇對股骨頭空骨陷窩率影響不大，但長期大量攝入乙醇能顯著增加股骨頭空骨陷窩率；且隨著乙醇灌胃時間延長，空骨陷窩率隨之增加。長期攝入乙醇致破骨細胞和成骨細胞、骨髓間充質干細胞活性降低可能是其原因[13～15]。

綜上所述，長時間(≥3個月)乙醇灌胃可使家兔股骨頭內骨內壓升高，骨小梁結構紊亂。

[1] 陳躍平,高輝,陳亮,等.乙醇對股骨頭髓內脂肪細胞的作用[J].中國組織工程研究,2013,17(35):6221-6227.

[2] Li J, Wang Y, Li Y, et al. The effect of combined regulation of the expression of peroxisome proliferator-activated receptor-γ and calcitonin gene-related peptide on alcohol-induced adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Mol Cell Biochem, 2014,392(1-2):39-48.

[3] 莫堅,盧培根,賈永龍,等.兔酒精性股骨頭缺血性壞死模型構建及超微結構觀察[J].廣西醫學,2014,36(12):1865-1867.

[4] Chen J, Liu W, Cao Y, et al. MMP-3 and MMP-8 single-nucleotide polymorphisms are related to alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head in Chinese males[J]. Oncotarget, 2017,8(15):25177-25188.

[5] Zhu ZH, Gao YS, Luo SH, et al. An animal model of femoral head osteonecrosis induced by a single injection of absolute alcohol: an experimental study[J]. Med Sci Monit, 2011,17(4):97-102.

[6] Zhai JL, Weng XS, Wu ZH. Effect of resveratrol on preventing steroid-induced osteonecrosis in a rabbit model[J]. Chin Med J (Engl), 2016,129(7):824-830.

[7] Gupta AK, Frank RM, Harris JD, et al. Arthroscopic-assisted core decompression for osteonecrosis of the femoral head[J]. Arthrosc Tech, 2013,3(1):e7-e11.

[8] Ait-Mou Y, Hsu K, Farman GP, et al. Titin strain contributes to the Frank-Starling law of the heart by structural rearrangements of both thin- and thick-filament proteins[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016,113(8):2306-2311.

[9] Mao Q, Wang W, Xu T, et al. Combination treatment of biomechanical support and targeted intra-arterial infusion of peripheral blood stem cells mobilized by granulocyte-colony stimulating factor for the osteonecrosis of the femoral head: a randomized controlled clinical trial[J]. J Bone Miner Res, 2015,30(4):647-656.

[10] 楊云,范海燕,黃健,等.酒精性股骨頭缺血壞死大鼠模型的制備[J].中國組織工程研究,2016,20(27):3977-3983.

[11] 劉華,魏愛淳,秦廣珍,等.雙合湯對酒精性股骨頭壞死的干預作用[J].中國實驗方劑學雜志,2016,22(5):141-146.

[12] Okazaki S, Nagoya S, Tateda K, et al. Experimental rat model for alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Int J Exp Pathol, 2013(94):312-319.

[13] Han N, Li ZC, Cai ZD, et al. P-glycoprotein overexpression in bone marrow-derived multipotent stromal cells decreases the risk of steroid-induced osteonecrosis in the femoral head[J]. J Cell Mol Med, 2016,20(11):2173-2182.

[14] Song H, Tao L, Wang F, et al. Effect of bone mesenchymal stem cells transplantation on the micro-environment of early osteonecrosis of the femoral head[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(11):14528-14534.

[15] 席立成,李宏宇.酒精對股骨頭局部微環境影響的機制研究進展[J].中國組織工程,2017,21(7):1137-1142.

[16] 陳剛,徐萬龍,錫林寶勒日,等.不同劑量全椎體適形調強放療對椎體轉移瘤的療效[J].江蘇醫藥,2013,39(8):874-877.

[17] Tian L, Dang XQ, Wang CS, et al. Effects of sodium ferulate on preventing steroid-induced femoral head osteonecrosis in rabbits[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2013,14(5):426-437.

廣西自然科學基金面上項目(2014GXNSFAA118186)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.010

R683.42

A

1002-266X(2017)48-0034-03

2017-07-26)