杜仲配伍黃芪對雌性大鼠去勢后骨質(zhì)疏松的影響

王吉博，王兆杰，安榮澤，彭浩，曾旋，王敏

(1遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，廣東珠海519041；2遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院)

杜仲配伍黃芪對雌性大鼠去勢后骨質(zhì)疏松的影響

王吉博1，王兆杰2，安榮澤2，彭浩1，曾旋2，王敏1

(1遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，廣東珠海519041；2遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院)

目的探討杜仲配伍黃芪對雌性大鼠去勢后骨質(zhì)疏松的治療效果。方法將雌性SD大鼠50只去勢處理后隨機(jī)分為杜仲組、黃芪組、杜仲與黃芪配伍組(配伍組)、雌激素組及模型組，并設(shè)假手術(shù)組，每組10只；前三組分別灌胃給予杜仲水煎液、黃芪水煎液及杜仲聯(lián)合黃芪水煎液，雌激素組給予尼爾雌醇，其余組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥12周。除假手術(shù)組外，其余各組在給藥期間肌注地塞米松磷酸鈉注射液，每周2次。給藥結(jié)束后檢測血清鈣、磷、堿性磷酸酶(ALP)、雌二醇(E2)、骨鈣素(BGP)及股骨扭力；收集殘骨進(jìn)行灰化處理，檢測骨鈣、磷、氯含量。結(jié)果①與假手術(shù)組比較，其他組血清E2水平均降低，ALP水平均升高；模型組血清鈣、磷水平降低，BGP水平升高。與模型組比較，杜仲組、黃芪組、配伍組、雌激素組血清鈣、磷、E2水平升高，ALP、BGP水平降低。與配伍組比較，杜仲組、黃芪組血清鈣、磷、E2水平降低，ALP、BGP水平升高；雌激素組血清ALP水平降低，E2水平升高。上述指標(biāo)組間比較P均<0.05。②杜仲組、黃芪組、配伍組、雌激素組、模型組、假手術(shù)組股骨扭力分別為(9.70±2.10)、(9.67±1.30)、(10.32±2.37)、(10.69±2.40)、(8.54±1.23)、(12.63±4.95)N/g，假手術(shù)組、配伍組、雌激素組均高于模型組(P均<0.05)。③與假手術(shù)組比較，模型組骨鈣、骨磷含量降低，骨氯含量升高；雌激素組骨鈣含量降低，骨磷、骨氯含量升高；杜仲組、黃芪組、配伍組骨氯含量升高。與模型組比較，杜仲組、黃芪組、配伍組骨鈣、骨磷含量升高，骨氯含量降低；雌激素組骨磷含量升高，骨氯含量降低。與配伍組比較，杜仲組、黃芪組骨鈣、骨磷含量降低，骨氯含量升高；雌激素組骨鈣含量降低，骨氯含量升高。上述指標(biāo)組間比較P均<0.05。結(jié)論杜仲配伍黃芪對雌性去勢大鼠骨質(zhì)疏松具有正向調(diào)節(jié)作用，提高股骨抗外力，抑制骨鈣、骨磷丟失，且效果優(yōu)于杜仲和黃芪單藥。

骨質(zhì)疏松；杜仲；黃芪；去勢；糖皮質(zhì)激素；大鼠

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMO)是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的一種[1]。隨著我國人口老齡化程度逐漸嚴(yán)重，PMO發(fā)病率逐年升高[2]。目前臨床治療骨質(zhì)疏松主要以單一靶點(diǎn)化學(xué)藥物為主，但效果均不理想[3，4]。臨床實(shí)踐證實(shí)，中藥可對骨質(zhì)疏松發(fā)揮整體治療作用，且不良反應(yīng)相對輕微，臨床療效確切[5]，但關(guān)于杜仲配伍黃芪治療PMO的研究較少。2015年1月～2016年12月，我們觀察了杜仲配伍黃芪對雌性大鼠去勢后骨質(zhì)疏松的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：8月齡雌性SD大鼠100只，體質(zhì)量250～280 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[動物合格證號：scxk(湘)2014-0010，清潔級]。大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，自由進(jìn)食及飲水。實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)水平BSL-1級，自然光照，溫度18～22 ℃，相對濕度50%～70%。主要藥物：杜仲，珠海萬寶中藥飲片有限公司，批號161001；黃芪，廣東匯群中藥飲片股份有限公司，批號20160901；地塞米松磷酸鈉注射液，貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字號H52020477，批號140328，規(guī)格：1 mL/5 mg；尼爾雌醇片，湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字號H19983206，批號131216，規(guī)格：5 mg。主要試劑盒：鈣、磷、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒，南京建成生物技術(shù)公司；雌二醇(E2)、骨鈣素(BGP)放射免疫試劑盒，北京原子高科股份有限公司。主要儀器：小動物骨骼強(qiáng)度測定儀，上海軟隆科技發(fā)展有限公司，型號：BW-YLS-16A；X-射線能譜儀，美國伊達(dá)克斯有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 去勢雌性大鼠制備 將90只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，給予水合氯醛(220 mg/kg)麻醉。麻醉后趴位固定，在大鼠腰部腎區(qū)偏下中間位置皮膚剪口2～3 cm，鈍性剝離至腹腔，用鑷子夾出子宮后結(jié)扎，摘除卵巢，再將子宮送回腹腔，縫合。術(shù)后肌注青霉素40萬U/(kg·d)，連續(xù)給藥3天。自術(shù)后7天開始連續(xù)5天行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，若涂片未發(fā)現(xiàn)角化上皮細(xì)胞，提示去勢大鼠造模成功。將未成功去勢或造模過程中死亡大鼠剔除本實(shí)驗(yàn)。優(yōu)選50只造模成功大鼠進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 動物分組處理 將50只去勢大鼠隨機(jī)分為五組，分別為杜仲組、黃芪組、杜仲與黃芪配伍組(配伍組)、雌激素組及模型組，每組10只。另取10只大鼠同法手術(shù)但不去勢(即不摘除卵巢)作為假手術(shù)組。杜仲組、黃芪組、配伍組分別灌胃給予杜仲水煎液(杜仲5.4 g/kg)、黃芪水煎液(黃芪5.4 g/kg)及杜仲聯(lián)合黃芪水煎液(杜仲2.7 g/kg、黃芪2.7 g/kg)；雌激素組給予尼爾雌醇(0.18 mg/kg)灌胃；模型組、假手術(shù)組給予等量蒸餾水灌胃。各組均于術(shù)后第7天開始給藥，1次/d，連續(xù)給藥12周。除假手術(shù)組外，其余各組在給藥期間肌注地塞米松磷酸鈉注射液，每周2次(周一、四)；假手術(shù)組注射等量生理鹽水。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 ①血清鈣、磷、ALP、E2與BGP：給藥結(jié)束后以腹腔注射水合氯醛(3.5%，10 mL/kg)麻醉大鼠，頸外靜脈采血，3 000 r/min離心15 min，獲得血清。采用全自動生化儀檢測血清鈣、磷、ALP，采用放射免疫法檢測血清E2、BGP，所有檢測嚴(yán)格參照試劑盒說明進(jìn)行操作。②股骨扭力：將完成采血的大鼠脫頸處死，解剖獲得左右兩側(cè)股骨(將股骨上附著的肌肉與結(jié)締組織完全剔除)，采用小動物骨骼強(qiáng)度測定儀檢測股骨扭力[6]。③骨灰鈣、磷、氯：完成扭力檢測后收集殘骨，以800 ℃進(jìn)行灰化處理，采用X-射線能譜儀檢測骨鈣、磷、氯含量。

2 結(jié)果

2.1 各組血清鈣、磷、ALP、E2與BGP水平比較 與假手術(shù)組比較，其他組血清E2水平均降低，ALP水平均升高；模型組血清鈣、磷水平降低，BGP水平升高(P均<0.05)。與模型組比較，杜仲組、黃芪組、配伍組、雌激素組血清鈣、磷、E2水平升高，ALP、BGP水平降低(P均<0.05)。與配伍組比較，杜仲組、黃芪組血清鈣、磷、E2水平降低，ALP、BGP水平升高；雌激素組血清ALP水平降低，E2水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清鈣、磷、ALP、E2與BGP水平比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與配伍組比較，▲P<0.05。

2.2 各組股骨扭力比較 杜仲組、黃芪組、配伍組、雌激素組、模型組、假手術(shù)組股骨扭力分別為(9.70±2.10)、(9.67±1.30)、(10.32±2.37)、(10.69±2.40)、(8.54±1.23)、(12.63±4.95)N/g，假手術(shù)組、配伍組、雌激素組均高于模型組(P均<0.05)。

2.3 各組骨鈣、磷、氯含量比較 與假手術(shù)組比較，模型組骨鈣、骨磷含量降低，骨氯含量升高；雌激素組骨鈣含量降低，骨磷、骨氯含量升高；杜仲組、黃芪組、配伍組骨氯含量升高。與模型組比較，杜仲組、黃芪組、配伍組骨鈣、骨磷含量升高，骨氯含量降低；雌激素組骨磷含量升高，骨氯含量降低。與配伍組比較，杜仲組、黃芪組骨鈣、骨磷含量降低，骨氯含量升高；雌激素組骨鈣含量降低，骨氯含量升高。上述指標(biāo)組間比較P均<0.05。見表2。

3 討論

現(xiàn)代中醫(yī)理論根據(jù)PMO的某些臨床癥狀，如易發(fā)骨折、腰背或全身多處疼痛、駝背等，將其歸屬于“骨痿”“骨枯”“骨極”“骨痹”等范疇[7]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎與骨的關(guān)系非常密切，早在《皇帝內(nèi)經(jīng)》中已有大量而明確的論述。腎是先天之本，主骨生髓，骨的生長、發(fā)育、衰弱與腎精盛衰密切相關(guān)。女性在絕經(jīng)之后，腎精虧虛，骨髓生化乏源，致骨骼脆弱。脾為后天之本，主百骸。先天之精有賴于后天脾胃運(yùn)化水谷精微的不斷充養(yǎng)，若脾胃虛弱，運(yùn)化乏力，先天之精無以充養(yǎng)，則精虧髓空，百骸痿廢。因此，本病的病因當(dāng)首責(zé)于腎虧，其次為脾虛。杜仲性味甘溫，入肝腎二經(jīng)，有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功，可用于治療各種腰痛，是防治骨質(zhì)疏松癥的一味良藥[8]。黃芪味甘，性微溫，歸肝、脾、肺、腎經(jīng)，是臨床上常用的補(bǔ)益藥，在治療骨質(zhì)疏松的方藥中頻繁應(yīng)用。由此可見，杜仲與黃芪的中藥藥理切中PMO病機(jī)。當(dāng)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，杜仲在促進(jìn)成骨樣細(xì)胞以及成骨細(xì)胞增殖方面均具有明確作用[9～12]。近年研究發(fā)現(xiàn)，黃芪在體外試驗(yàn)中可抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，并通過有效防止大鼠去勢后骨量丟失而發(fā)揮防治PMO作用[13]。

表2 各組骨鈣、磷、氯含量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與配伍組比較，▲P<0.05。

將去卵巢大鼠作為臨床研究骨質(zhì)疏松癥的首推動物模型同時獲得了WHO與美國食品藥品管理局的認(rèn)可[14]。大鼠在去除卵巢后其體內(nèi)雌激素水平快速降低，與此同時對破骨細(xì)胞的抑制作用相應(yīng)減弱，骨吸收呈亢進(jìn)狀態(tài)。在此種情況下，代償性骨形成將會增強(qiáng)，繼而表現(xiàn)為高轉(zhuǎn)換狀態(tài)；但實(shí)際情況卻是骨形成仍不及骨吸收，整個骨代謝處于失衡狀態(tài)，總體骨量及骨強(qiáng)度較正常水平減少或下降，這與婦女絕經(jīng)后的骨丟失狀態(tài)大體上一致。外源性糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松是一種發(fā)病率僅次于PMO的骨質(zhì)疏松類型，主要發(fā)生于長期使用糖皮質(zhì)激素治療患者，長期使用糖皮質(zhì)激素能抑制成骨細(xì)胞活性，并促進(jìn)破骨細(xì)胞活化，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。外源性糖皮質(zhì)激素所致的骨質(zhì)疏松是當(dāng)前最常見的藥源性骨質(zhì)疏松造模方法[15]。本研究通過去勢及糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)建立的骨質(zhì)疏松雌性大鼠模型既符合國際骨質(zhì)疏松建模習(xí)慣，也接近臨床PMO患者的實(shí)際情況。

PMO的形成是一個相對漫長的過程，有效的骨活性藥物臨床應(yīng)用3～4年也未必能顯示出顯著的治療效果，在短時間內(nèi)很難看到直觀作用[16]。因某些血清生化指標(biāo)可在一定程度上反映骨代謝的實(shí)際水平，故可將其作為評價藥物治療效果的主要參考依據(jù)。機(jī)體正常的骨代謝調(diào)節(jié)主要包括三個方面，分別為腸道的吸收與排泌、腎臟的濾過與重吸收以及骨骼的礦化與再吸收。在上述過程中，血液中鈣、磷含量將直接影響骨的鈣化及溶解[17]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，各組血鈣與血磷均有不同程度升高，且配伍組效果強(qiáng)于單藥，提示杜仲配伍黃芪可提高血鈣、磷濃度，促進(jìn)鈣、磷沉積，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)成骨細(xì)胞增殖活動。動物實(shí)驗(yàn)與臨床研究均表明，女性在絕經(jīng)后其機(jī)體雌激素水平降低是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的主要原因。E2作為調(diào)節(jié)骨代謝的重要雌激素，在絕經(jīng)后其水平迅速降低，引起骨轉(zhuǎn)換加快。BGP又稱骨Gla蛋白，是由49個氨基酸殘基組成的直鏈多肽，屬非骨膠原蛋白的一種。血BGP來源于成骨性細(xì)胞譜系，主要由非增殖期成骨細(xì)胞分泌入血，BGP含有維生素K依賴性γ-輕基骨氨酸，具有結(jié)合鈣的特性。因此認(rèn)為BGP可能參與了骨礦化調(diào)節(jié)。骨轉(zhuǎn)換率增加時血BGP升高，BGP是反映骨形成的特異指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，模型組血清E2水平降低，BGP水平升高。當(dāng)卵巢被摘除后，雌性大鼠體內(nèi)的雌激素嚴(yán)重不足，繼而導(dǎo)致對破骨細(xì)胞的抑制作用顯著減弱，骨吸收亢進(jìn)導(dǎo)致代償性骨形成增強(qiáng)，最終呈現(xiàn)出骨的高轉(zhuǎn)換狀態(tài)。在骨吸收大于骨形成的情況下，骨代謝平衡遭到破壞，繼而導(dǎo)致骨丟失，誘導(dǎo)骨高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，去勢大鼠在接受杜仲配伍黃芪的藥物處理后，其體內(nèi)E2含量明顯增加，BGP含量降低，提示杜仲與黃芪配伍對骨質(zhì)疏松有明顯的正向調(diào)節(jié)作用，其具體作用機(jī)制可能是兩藥可直接提高去勢大鼠的雌激素水平或發(fā)揮類雌激素作用。ALP由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，其活性水平直接反映成骨細(xì)胞活性。成骨活躍時ALP水平升高，一部分直接參與骨鈣化；另一部分釋放入血，使血中酶活性增強(qiáng)。因此，ALP被認(rèn)為是評價機(jī)體成骨活性和骨組織鈣化能力的具有較高特異性的指標(biāo)[18]。本實(shí)驗(yàn)中去勢大鼠由于雌激素減少或缺乏使其對破骨細(xì)胞的抑制作用解除，骨吸收顯著增加，隨之骨形成增加，ALP活性增加，提示去勢大鼠成骨細(xì)胞活躍、骨轉(zhuǎn)換增強(qiáng)。在藥物干預(yù)后代償性反應(yīng)相應(yīng)減弱，ALP水平降低。

骨力學(xué)強(qiáng)度下降是PMO的本質(zhì)特征，骨生物力學(xué)和骨鈣、磷含量是衡量骨質(zhì)量的重要指標(biāo)，可以反映骨質(zhì)疏松的程度，亦是預(yù)測骨折危險性的重要指標(biāo)。另有研究表明，病骨中氯含量一般較正常骨高出兩倍以上。本研究對實(shí)驗(yàn)大鼠的股骨生物力學(xué)扭力進(jìn)行檢測，同時檢測骨灰中鈣、磷、氯含量。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組骨鈣、骨磷含量降低，骨氯含量升高；與模型組比較，杜仲組、黃芪組、配伍組骨鈣、骨磷含量升高，骨氯含量降低。提示杜仲配伍黃芪可明顯提高去勢雌性大鼠股骨的抗外力性能，且能抑制骨鈣、骨磷丟失。

綜上所述，杜仲配伍黃芪對去勢雌性大鼠骨質(zhì)疏松可發(fā)揮明顯的正向調(diào)節(jié)作用，提高股骨的抗外力性能，抑制骨鈣、骨磷丟失，且效果優(yōu)于杜仲和黃芪單藥。

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貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項目(黔科合LH字[2014]7580號)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.009

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A

1002-266X(2017)48-0031-04

2017-04-09)