HELQ對骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移的影響及機制

鐘俊橋，周云飛，劉家明，劉東寧，周揚，劉志禮

(1井岡山大學附屬醫院，江西吉安343000；2南昌大學第一附屬醫院；3深圳市南山區人民醫院)

HELQ對骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移的影響及機制

鐘俊橋1，周云飛2，劉家明2，劉東寧3，周揚2，劉志禮2

(1井岡山大學附屬醫院，江西吉安343000；2南昌大學第一附屬醫院；3深圳市南山區人民醫院)

目的探討POLQ樣蛋白解旋酶(HELQ)對骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移的影響及作用機制。方法將體外培養的人源骨肉瘤細胞系U2-OS、143B隨機分為Lv-HELQ組、NC組、Lv-shHELQ組，分別轉染Lv-HELQ、Lv-Negative、Lv-shHELQ慢病毒載體。轉染48 h時，采用Western blotting法檢測HELQ蛋白表達，結果顯示兩種細胞Lv-HELQ組HELQ蛋白相對表達量均高于NC組，Lv-shHELQ組均低于NC組，組間比較P均<0.05，提示HELQ轉染成功。三組(兩種細胞)轉染48 h時，采用CCK8法檢測細胞增殖情況(光密度值)，采用Wound healing法檢測細胞遷移率，采用Transwell invasion法檢測細胞穿膜細胞數(侵襲能力)，采用彗星實驗檢測彗星尾部DNA百分比。結果兩種細胞Lv-HELQ組光密度值均高于NC組，Lv-shHELQ組光密度值均低于NC組，組間比較P<0.05或<0.01。兩種細胞Lv-HELQ組細胞遷移率、穿膜細胞數及均彗星尾部DNA百分比均低于NC組，Lv-shHELQ組均高于NC組，組間比較P均<0.05。結論HELQ可抑制人骨肉瘤細胞增殖、侵襲、轉移，修復DNA損傷可能是其作用機制。

骨肉瘤；POLQ樣蛋白解旋酶；人骨肉瘤細胞；細胞增殖；細胞侵襲；細胞遷移；DNA損傷

骨肉瘤的發生、發展是一個多步驟、多基因參與的復雜序貫過程。DNA損傷修復基因失活是其發生的重要原因之一[1,2]。POLQ樣蛋白解旋酶(HELQ)是近年發現的一種多功能DNA解螺旋酶，可催化雙鏈DNA沿3′-5′方向解螺旋，在維持基因組穩定性、修復DNA損傷中發揮重要作用[3]。2014年3月～2015年9月，本研究觀察HELQ對骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移及DNA損傷的影響，旨在為進一步明確HELQ在骨肉瘤發生、發展中的作用及分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人源骨肉瘤細胞系U2-OS、143B購于上海中科院細胞庫。慢病毒載體Lv-HELQ、Lv-Negative、Lv-shHELQ由武漢英琪公司設計并構建。RPMI 1640培養基、DMEM高糖培養基、FBS購于美國Gibco公司，Transwell侵襲小室(8.0 μm孔徑PC膜)購于美國Corning公司，基質膠購于美國BD公司，Western blotting上樣蛋白Marker和NC膜購于Millipore公司，鼠抗人HELQ一抗購于美國Santa Cruz公司，二抗購于北京天根生化有限公司。

1.2 細胞培養及轉染 U2-OS、143B細胞分別以1×105個/孔密度接種于6孔板，用含10% FBS的DMEM 1640培養基于37 ℃、5% CO2、飽和濕度環境中培養，培養18～24 h使細胞密度達2×105個/孔。將兩種細胞分別隨機分為Lv-HELQ組、NC組、Lv-shHELQ組，將原培養基用含6 μg/mL polybrene的2 mL新鮮培養基替換，分別加入Lv-HELQ、Lv-Negative、Lv-shHELQ慢病毒載體，37 ℃孵育48 h。收集各組細胞，采用Western blotting法檢測HELQ蛋白表達。具體方法：RIPA裂解細胞并提取總蛋白，BCA法蛋白定量；10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將分離的蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；加入HELQ一抗(1∶500)，室溫孵育過夜；TBST洗膜3次，加入羊抗鼠二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h。以GAPDH為內參。用Image J 軟件對條帶灰度值進行分析，重復6 次實驗。結果顯示，U2-OS細胞Lv-shHELQ組、NC組、Lv-HELQ組HELQ蛋白相對表達量分別為(0.040 0±0.007 3)、(0.084 7±0.002 9)、(0.180 4±0.011 7)，143B細胞分別為(0.468 9±0.002 9)、(0.647 2±0.038 2)、(0.764 9±0.033 3)；兩種細胞Lv-HELQ組HELQ蛋白相對表達量均高于NC組，Lv-shHELQ組均低于NC組，組間比較P均<0.05，見圖1。提示HELQ轉染成功。

1.3 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。分別將轉染48 h的各組U2-OS、143B細胞按4×103個/孔接種于96孔板，第2天貼壁后每孔加入10% CCK8溶液100 μL，37 ℃、5% CO2條件下培養2 h，空白孔調零，讀取各孔光密度(OD)值。

圖1 人骨肉瘤細胞系143B、U2-OS中HELQ蛋白表達電泳圖

1.4 細胞遷移能力檢測 采用Wound healing法。將轉染48 h的各組U2-OS、143B細胞調整密度為5×105個/mL接種于6孔板，待形成單層貼壁細胞，用10 μL槍頭在單層細胞表面劃一直線，PBS漂洗2次去除劃落細胞；分別加入無血清RPMI 1640及DMEM培養液繼續培養24 h，倒置顯微鏡下觀察劃痕中細胞遷移情況并拍照。Image J軟件測量遷徙距離，計算細胞遷移率。

1.5 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell invasion法。將轉染48 h的各組U2-OS、143B細胞消化，用含10 g/L FBS的無血清培養基重懸，調整細胞密度為1×105個/mL，分別取150 μL細胞懸液接種于小室內；將小室放入含10% FBS的培養液(600 μL/孔)中繼續培養 24 h。取出小室，吸棄上室液體，PBS漂洗2次，95%乙醇固定10 min，用棉簽擦凈小室膜上側未遷移的細胞；4 g/L結晶紫染色20 min，PBS漂洗2次。倒置顯微鏡下隨機讀取10個視野，觀察細胞穿膜情況并拍照，Image J軟件計數穿膜細胞數。

1.6 細胞DNA損傷檢測 采用彗星實驗。將0.6%的正常熔點瓊脂糖(NMPA，PBS配制)于微波爐中加熱融化，浸泡磨砂玻片，用吸水紙將玻片滑面及四周吸干，自然晾干備用。取細胞懸液10 μL，向其中加入70 μL 37 ℃的0.7%低熔點瓊脂糖(LMPA，PBS配制)，混勻后迅速滴于37 ℃預熱的玻片上，立即蓋上蓋玻片，4 ℃固化10 min。輕輕取下蓋玻片，將玻片浸于新鮮配制并預冷的細胞裂解液中，4 ℃避光裂解1 h。從裂解液中取出載玻片，用PBS浸泡玻片。用紙巾吸去玻片上殘留的液體，置于水平電泳槽中，加新鮮配制的堿性電泳緩沖液至高于玻片表面3 mm以上，避光解旋30 min。電壓25 V，調整液面高度使電流達到300 mA，電泳25 min。電泳完畢取出玻片，PBS浸泡以中和強堿。用紙巾吸去玻片上殘留的液體，滴加20 μg/mL溴化乙錠(EB)20 μL，蓋上蓋玻片，采用熒光顯微鏡在515～560 mm波長激發光下觀察核DNA和遷移DNA(即彗星尾)。每個樣本隨機選擇100個細胞，Cometscore Version1.5軟件分析彗星尾部DNA百分比。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 U2-OS細胞Lv-HELQ組、NC組、Lv-shHELQ組OD值分別為0.730±0.017、0.419±0.025、0.341±0.022，143B細胞分別為0.868±0.045、0.585±0.019、0.441±0.019，兩種細胞Lv-HELQ組OD值均高于NC組、Lv-shHELQ組OD值均低于NC組，組間比較P<0.05或<0.01。

2.2 各組細胞遷移能力比較 U2-OS細胞Lv-HELQ組、NC組、Lv-shHELQ組遷移率分別為(51.2±10.6)%、(65.7±16.4)%、(81.4±14.3)%，143B細胞分別為(60.6±10.7)%、(70.5±16.3)%、(89.2±7.1)%；兩種細胞Lv-HELQ組遷移率均低于NC組，Lv-shHELQ組均高于NC組，組間比較P均<0.05。

2.3 各組細胞侵襲能力比較 U2-OS細胞Lv-HELQ組、NC組、Lv-shHELQ組穿膜細胞數分別為(209.2±38.6)、(465.4±107.8)、(642.3±125.6)個，143B細胞分別為(185.3±40.4)、(185.3±40.4)、(185.3±40.4)個；兩種細胞Lv-HELQ組穿膜細胞數均低于NC組，Lv-shHELQ組均高于NC組，組間比較P均<0.05。

2.4 各組細胞DNA損傷情況比較 U2-OS細胞Lv-HELQ組、NC組、Lv-shHELQ組彗星尾部DNA百分比分別為(45.809 8±15.709 6)%、(64.424 1±16.386 6)%、(86.163 2±11.385 6)%，143B細胞分別為(54.161 0±14.446 9)%、(71.098 9±17.496 7)%、(83.596 1±12.784 2)%；兩種細胞Lv-HELQ組彗星尾部DNA百分比均低于NC組，Lv-shHELQ組均高于NC組，組間比較P均<0.05。

3 討論

人體細胞每時每刻都在發生DNA損傷，這些損傷可來自內源性因素，如DNA復制過程中的失誤和代謝副產品[4]，亦可來自環境中的紫外照射、電離輻射、化學物質等眾多外源性因素[5]。真核細胞中存在著一系列復雜的DNA損傷反應信號傳導系統，具有保護基因組完整性的功能。DNA修復是機體對DNA損傷的主要生物學反應之一，可以促使DNA中已經損傷的、不合適的或錯配的堿基恢復本來狀態[6]。由此可見，DNA損傷修復和DNA信號傳導系統之間形成了一個聯系密切且相互影響的復雜網絡，使細胞作為一個整體對DNA損傷做出反應。如果DNA損傷得到了正確修復，細胞功能就能得到恢復；如果修復過程中出現缺失、插入等，導致異常堿基累積，則可能使細胞無限制地進入細胞周期，從而引起癌癥的發生。在許多人類腫瘤早期病變臨床樣本(如膀胱癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌)中可以發現DNA損傷。

HELQ可幫助修復細胞增殖時DNA復制過程中所發生的DNA損傷。如果HELQ基因缺失或發生突變，DNA損傷不能得到及時正確的修復，DNA錯誤增加，則增加癌癥發生的機會。研究發現，HELQ蛋白與卵巢腫瘤、垂體瘤中生殖細胞的缺失有關[7]；HELQ家族成員與DNA股間交聯(ICL)等DNA復制障礙的修復相關[8]；敲除HELQ基因的小鼠表現出生殖能力低下、生殖細胞缺失、對ICL敏感以及致癌傾向[9]；HELQ位點內或其位點附近的單核苷酸多樣性可增加眾多腫瘤的發病風險，如上消化道腫瘤、卵巢腫瘤及頭頸部腫瘤等[10～13]。但HELQ與骨肉瘤發生、發展的關系尚不明確。

本研究結果顯示，通過慢病毒轉染上調骨肉瘤細胞中HELQ表達可以抑制骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移，下調HELQ表達可促進骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移。彗星實驗結果顯示，上調HELQ表達可降低骨肉瘤細胞中DNA損傷水平，下調HELQ表達水平可提高骨肉瘤細胞中DNA損傷水平。提示HELQ可能通過促進DNA損傷修復抑制骨肉瘤細胞的惡性表型。有研究報道，DNA解螺旋酶在腫瘤細胞和腫瘤組織中高表達有助于抵抗放療及化療所引起的DNA損傷[14,15]。但HELQ參與骨肉瘤發生、發展的具體作用及作用機制，還需進一步探討。此外，人骨肉瘤的發病機制較為復雜，HELQ并不是惟一一個調控骨肉瘤惡性表型及其發生、發展的DNA修復因子[16]。HELQ與其他骨肉瘤惡性表型相關的DNA修復信號通路之間的相互作用還需要更多的實驗進行驗證。

綜上所述，HELQ可抑制人骨肉瘤細胞增殖、侵襲、轉移，修復DNA損傷可能是其作用機制。

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EffectsofHELQonproliferation,invasion,andmigrationofosteosarcomacells

ZHONGJunqiao1,ZHOUYunfei,LIUJiaming,LIUDongning,ZHOUYang,LIUZhili

(1TheAffiliatedHospitalofJinggangshanUniversity,Ji'an343000,China)

ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of HELQ (helicase, POLQ-like) on the proliferation, invasion, and migration of osteosarcoma cells.MethodsThe human osteosarcoma cell lines (U2-OS and 143B) were transfected with Lv-HELQ, Lv-Negative, Lv-shHELQ, respectively, and were divided into three groups: Lv-HELQ group, NC group, and Lv-shHELQ group. The expression of HELQ protein at 48 h was detected by Western blotting. The results showed that the expression of HELQ in these two cell lines of the Lv-HELQ group was significantly higher, while the expression of HELQ in these two cell lines of the Lv-shHELQ group was significantly lower than that in the control group (allP<0.05), which indicated that the transfection was successful. At 48 h after transfection, the proliferation, migration, and invasion abilities of these two cell lines, and DNA damage levels were investigated by CCK8, Wound healing, Transwell invasion, and comet assay, respectively.ResultsThe OD values of these two cell lines were significantly higher in the Lv-HELQ group but significantly lower in the Lv-shHELQ group as compared with those of the NC group (P<0.05 orP<0.01). The migration rate, transmembrane cells, and percentage of DNA in tail DNA of these two cell lines were significantly lower in the Lv-HELQ group but significantly higher in the Lv-shHELQ group as compared with those of the NC group (allP<0.05).ConclusionHELQ can inhibit the proliferation, invasive, and migration of osteosarcoma cells by repairing the DNA damage.

osteosarcoma; helicase, POLQ-like (HELQ); human osteosarcoma cells; cell proliferation; cell invasion; cell migration; DNA damage

鐘俊橋(1976-)，男，副主任醫師，研究方向為骨腫瘤轉移及其機制。E-mail： 11363239@qq.com

劉志禮(1973-)，男，主任醫師，研究方向為骨腫瘤轉移及其機制。E-mail： zgm7977@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.005

R738.1

A

1002-266X(2017)48-0015-04

2017-08-02)