尾靜脈移植高表達(dá)Aqp1基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對股骨骨折大鼠骨愈合的影響

孟凡彪，劉寶華，劉佐君

(深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳518060)

尾靜脈移植高表達(dá)Aqp1基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對股骨骨折大鼠骨愈合的影響

孟凡彪，劉寶華，劉佐君

(深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳518060)

目的探討尾靜脈移植高表達(dá)水通道蛋白1(Aqp1)基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對股骨骨折大鼠骨愈合的影響。方法利用慢病毒系統(tǒng)建立穩(wěn)定高表達(dá)Aqp1基因的MSCs(簡稱Aqp1-MSCs)，采用Dun 趨化小室系統(tǒng)實(shí)時(shí)驗(yàn)證MSCs、Aqp1-MSCs遷移速率。建立SD大鼠股骨骨折模型，并隨機(jī)分為觀察組和對照組各10只，建模2天分別由尾靜脈移植Aqp1-MSCs及MSCs。移植后4周行X線檢查，觀察骨折愈合情況；取骨折股骨標(biāo)本，采用micro-CT掃描后進(jìn)行皮質(zhì)骨3D重建，檢測重建皮質(zhì)骨的新骨生成比(BV/TV)及骨密度(BMD)；應(yīng)用四點(diǎn)斷裂實(shí)驗(yàn)分析愈合后股骨的力學(xué)參數(shù)，即骨折部位承受最大力、能量與韌性。結(jié)果Aqp1-MSCs與MSCs均具有定向趨向性，Aqp1-MSCs及MSCs遷移速率分別為(5.18±0.29)、(2.44±0.21)μm/10 min(P<0.05)。觀察組和對照組BV/TV分別為0.18±0.01、0.15±0.02(P>0.05)，BMD分別為(587.20±16.53)、(511.60±27.89)mgHA/ccm(P<0.05)。兩組骨折部位承受的最大力和能量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，觀察組組織韌性高于對照組(P<0.05)。結(jié)論尾靜脈移植Aqp1-MSCs可促進(jìn)股骨骨折大鼠骨愈合；通過Aqp1誘導(dǎo)MSCs遷移可能是其作用機(jī)制。

股骨骨折；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；水通道蛋白1；細(xì)胞遷移；大鼠

骨折多發(fā)生于交通事故、運(yùn)動意外、跌倒等。大部分骨折治療效果較好，但愈合周期長、延遲愈合或骨不連等臨床問題尚需解決[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是來源于骨髓的具有成骨、成脂與成軟骨三系分化能力的成體干細(xì)胞，其在體外易大量擴(kuò)增，且免疫原性較低。目前，臨床已有成功應(yīng)用MSCs治療骨折的報(bào)道[2]。水通道蛋白1(Aqp1)是最早鑒定出負(fù)責(zé)細(xì)胞水分運(yùn)輸?shù)钠叽慰缒さ鞍譡3]，廣泛分布于各個(gè)組織，主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞，可促進(jìn)腫瘤血管新生[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Aqp1通過調(diào)節(jié)β-catenin、FAK表達(dá)，促進(jìn)MSCs遷移到骨折損傷部位[5]。2014年9月～2016年6月我們進(jìn)行本研究，探討尾靜脈移植高表達(dá)Aqp1基因的MSCs(簡稱Aqp1-MSCs)對股骨骨折大鼠骨愈合的影響。

1 材料

SD大鼠20只，雌雄不限，6～8周齡，體質(zhì)量200 g左右，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(動物許可證號：44007200041000)。所涉及的動物移植實(shí)驗(yàn)均通過深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

主要試劑：質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒購于Axygen公司(杭州)，低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶與opti-MEM培養(yǎng)液購于美國Gibco公司，脂質(zhì)體2000(LipofectamineTM2000)購于美國Invitrogen公司，克氏針(φ1.2 mm)購于美國Stryker公司。高分辨率X射線儀(MX-20)購于美國Faxitron公司，viva CT 40購于瑞士Scanco Medical公司。Aqp1抗體、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司。

2 方法與結(jié)果

2.2 Aqp1-MSCs構(gòu)建 采用PCR法將大鼠Aqp1基因(NM_012778.1)構(gòu)建到載體plenti6-V5中，用于慢病毒包裝。將質(zhì)粒pCMV-VSVG 2.8 μg、pMDLg-RRE 5.28 μg、pRSV-REV 4 μg、pLenti6-Aqp1 8 μg 與500 μL Opti-MEM混勻在一個(gè)EP管，同時(shí)將50 μL PEI與500 μL Opti-MEM混勻在另一個(gè)Ep管。將兩管內(nèi)容物混勻并室溫放置15 min，加入到70%融合的293T培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6 h換成新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h收集培養(yǎng)液上清，即為病毒粗提液。根據(jù)病毒滴度，將相應(yīng)的病毒粗提液加入鋪有MSCs的6孔板中，培養(yǎng)24 h換液。采用blasticidin(10 μg/mL)篩選2周得到Aqp1-MSCs細(xì)胞株，進(jìn)行Western blotting檢測驗(yàn)證。結(jié)果顯示，慢病毒感染MSCs的感染效率接近100%。高表達(dá)Aqp1并未影響MSCs形態(tài)，篩選出Aqp1-MSCs細(xì)胞株。

2.3 Aqp1-MSCs遷移速率檢測 采用Dun 趨化小室分析。將無血清培養(yǎng)液置于內(nèi)室，將含血清培養(yǎng)液置于外室，分別覆蓋含70%融合Aqp1-MSCs及MSCs的蓋玻片。將蓋玻片置于連有攝像機(jī)的倒置顯微鏡上，利用軟件Kinetic(Kinetic Imaging Ltd，英國)記錄橋(bridge)上細(xì)胞遷移軌跡，并用內(nèi)置軟件分析細(xì)胞遷移的方向與速率。結(jié)果顯示，Aqp1-MSCs與MSCs均具有定向趨向性。對遷移速率連續(xù)300 min追蹤分析發(fā)現(xiàn)，Aqp1-MSCs及MSCs的遷移速率分別為(5.18±0.29)、(2.44±0.21)μm/10 min，兩者比較P<0.05。

2.4 Aqp1-MSCs對股骨骨折愈合的影響

2.4.1 大鼠骨折模型建立及Aqp1-MSCs移植 根據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道方法建立大鼠股骨骨折模型。將20只SD大鼠隨機(jī)分為觀察組和對照組各10只。兩組均在常規(guī)麻醉狀態(tài)下暴露股骨，利用電鋦在股骨骨干處進(jìn)行橫切截?cái)?，并插入克氏針進(jìn)行內(nèi)固定。利用數(shù)字化X射線儀對骨折情況進(jìn)行評估。結(jié)果顯示，骨折類型為橫形斷裂，無粉碎性骨折、斜形骨折與螺旋骨折。骨折手術(shù)后2天，觀察組和對照組分別由尾靜脈移植Aqpl-MSCs及MSCs，細(xì)胞數(shù)均為1×106個(gè)。

2.4.2 大鼠骨折愈合情況及骨折愈合后骨折部位的力學(xué)分析 移植后4周對骨折股骨進(jìn)行X線照射檢查，結(jié)果顯示兩組骨折表面均愈合。將大鼠麻醉處死，取骨折股骨標(biāo)本。將兩組股骨標(biāo)本置于塑料圓柱形管中進(jìn)行micro-CT掃描(電壓70 keV、電流114 μA)。掃描以生長板為起點(diǎn)至遠(yuǎn)端7.98 mm處，每一層掃描厚度為19 μm(總計(jì)420層)。采用半自動方法確定輪廓，以區(qū)分骨小梁中的皮質(zhì)骨。根據(jù)CT掃描圖像對皮質(zhì)骨進(jìn)行3D重建[7]，參數(shù)為：sigma=1.2，support=2，threshold=190。利用內(nèi)附軟件評估3D重建皮質(zhì)骨的新骨生成比(BV/TV)及骨密度(BMD)。BV指新骨形成量，TV是骨總量。結(jié)果顯示，觀察組較對照組骨折溝變淺、骨痂減少，即骨折愈合更好。觀察組及對照組BV/TV分別為0.18±0.01、0.15±0.02，兩組比較P>0.05，觀察組及對照組BMD分別為(587.20±16.53)、(511.60±27.89)mgHA/ccm，兩組比較P<0.05。

在亨氏材料試驗(yàn)機(jī)(H25KS; Hounsfield Test Equipment)上設(shè)置250 N的總力，應(yīng)用四點(diǎn)斷裂試驗(yàn)分析愈合后股骨的力學(xué)參數(shù)。將股骨標(biāo)本水平放置在支持的兩點(diǎn)上，對骨折位置以5 mm/min進(jìn)行施壓，壓力方向與骨干方向垂直，致骨斷裂，利用內(nèi)置軟件分析骨折部位承受的最大力、能量與韌性。

結(jié)果顯示，兩組骨折部位承受的最大力和能量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，觀察組組織韌性高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組骨折愈合后骨折部位承受的最大力、能量及組織韌性比較

注:與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

MSCs是一種多潛能成體干細(xì)胞，其臨床應(yīng)用是再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，為治療組織損傷提供了新的可能，目前已應(yīng)用于治療糖尿病、心肌梗死、炎癥、骨折等多種疾病[8～10]。在MSCs應(yīng)用中的瓶頸問題是如何將MSCs移植到體內(nèi)。原位注射MSCs的方式較為直接有效，但臨床創(chuàng)傷較大，不利于重復(fù)應(yīng)用[11，12]；通過血液循環(huán)輸入是有效而無創(chuàng)的方法，但由循環(huán)系統(tǒng)輸入MSCs需要細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力才能到達(dá)損傷部位[13,14]。文獻(xiàn)報(bào)道，體外培養(yǎng)的MSCs形態(tài)較體內(nèi)原始細(xì)胞大，不易穿過毛細(xì)血管[15]；血液移植的MSCs大部分被潴留在肺部，影響肺的正常生理功能，并降低治療效果。因此，提高M(jìn)SCs的遷移能力對提高其干預(yù)效果具有重要意義。

研究證實(shí)，Aqp1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及腫瘤內(nèi)血管生成[12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Aqp1通過調(diào)節(jié)FAK與β-catenin表達(dá)促進(jìn)MSCs遷移到骨折部位[5]。本研究首先構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Aqp1的MSCs細(xì)胞系，利用Dun 趨化小室系統(tǒng)實(shí)時(shí)觀察Aqp1對MSCs遷移的影響，進(jìn)一步采用大鼠骨折模型在體內(nèi)分析Aqp1-MSCs對骨折愈合的影響。結(jié)果顯示，Aqp1-MSCs遷移速度較MSCs顯著提高，Aqp1-MSCs移植可促進(jìn)骨折愈合，提高骨折部位的BMD與韌性。上述結(jié)果說明，Aqp1對MSCs介導(dǎo)的骨折修復(fù)具有促進(jìn)作用。由于Aqp1對MSCs遷移的促進(jìn)作用，因而骨折愈合能力的增強(qiáng)可能是更多的MSCs到達(dá)損傷部位進(jìn)行修復(fù)。本研究中Aqp1-MSCs移植并未顯著提高骨折大鼠BV/TV。新骨形成質(zhì)量與骨折部位微環(huán)境、骨折個(gè)體骨折創(chuàng)傷面、愈合過程中炎癥反應(yīng)及后期血管形成等因素均有關(guān)，單純改變遷移速度可能不足以影響新骨形成。

綜上所述，尾靜脈移植Aqp1-MSCs可促進(jìn)股骨骨折大鼠骨愈合；通過Aqp1誘導(dǎo)MSCs遷移可能是其作用機(jī)制。

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EffectsoftransplantationofAqp1-MSCsviacaudalveinonhealingprocessofratswithfemurfracture

MENGFanbiao,LIUBaohua,LIUZuojun

(ShenzhenUniversitySchoolofMedicine,Shenzhen518060,China)

ObjectiveTo investigate the effects of transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) with high expression of aquaporin 1 (Aqp1) via caudal vain on the healing process of rats with femoral fractures.MethodsMSCs (Aqp1-MSCs) stably expressing Aqp1 gene were established by lentivirus system, and the migration rates of MSCs and Aqp1-MSCs were verified by Dun chemotactic chamber system. Twenty SD rats with femur fractures were randomly divided into the observation group and the control group with 10 in each. Aqp1-MSCs and MSCs via caudal vein were administrated 2 days after surgery. The fractured femur were examined by X ray to observe the healing process 4 weeks after transplantation. Furthermore, the femora were collected and scanned using micro-CT for 3D remodeling to examine the new cortical bone formation ration (BV/TV)and bone density (BMD). In addition, four points break analysis was used to examine the mechanical parameters of femora such as the maximal force, energy, and stiffness.ResultsAqp1-MSCs and MSCs had specific chemotaxis, and the migration rates of Aqp1-MSCs and MSCs were (5.18±0.29) and (2.44±0.21) m/10 min, respectively. The BV/TV of the observation group and control group were 0.175%±0.01% and 0.15%±0.02%, respectively (P>0.05). The BMD of the two groups were (587.2±16.53) and (511.6±27.89) mgHA/ccm, respectively (P<0.05). No significant difference was found in the maximal force and energy between these two groups (bothP>0.05), while the stiffness of the observation group was significantly higher than that of the control group (P<0.05).ConclusionTransplantation of Aqp1-MSCs via caudal vain can promote the healing process of rats with femoral fractures by Aqp1 inducing the migration of MSCs.

femoral fracture; bone marrow mesenchymal stem cells; aquaporin-1; cell migration

深圳市科技創(chuàng)新計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(CXZZ20140903103747508)。

孟凡彪(1986-)，男，博士后，研究方向?yàn)楦杉?xì)胞治療骨相關(guān)疾病。E-mail： mfanbiao@szu.edu.cn

劉佐君(1982-)，男，博士后，研究方向?yàn)楦杉?xì)胞與再生醫(yī)學(xué)。E-mail： liu-zuo-jun@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.004

Q291;R683

A

1002-266X(2017)48-0012-03

2017-04-06)