大鼠股骨Masquelet誘導膜實驗模型的建立

曾志奎，黃楓，黃培鎮，李悅，蔡群斌，周琦石，姜自偉，李定，鄭升鵬

(1廣州中醫藥大學，廣州510405；2廣州中醫藥大學第一附屬醫院)

·論著·

大鼠股骨Masquelet誘導膜實驗模型的建立

曾志奎1，黃楓2，黃培鎮2，李悅2，蔡群斌2，周琦石2，姜自偉2，李定1，鄭升鵬1

(1廣州中醫藥大學，廣州510405；2廣州中醫藥大學第一附屬醫院)

目的建立一種用于研究Masquelet誘導膜的SD大鼠股骨實驗模型。方法選取雄性SD大鼠24只，隨機分為觀察組和對照組各12只。兩組均在股骨中段取出4 mm骨塊，均采用鋼板固定，觀察組置入PMMA骨水泥塊，對照組不置入骨水泥塊。統計兩組術后進食、排便、行走、切口愈合及并發癥發生情況。造模4周時分別采集觀察組PMMA骨水泥塊周圍誘導膜組織及對照組截骨區誘導膜組織進行HE染色，觀察組織病理學變化；對兩組術肢拍攝X線片，觀察截骨斷端對位情況，以及鋼板、螺釘在位情況。結果兩組術后均能正常進食及排便，術后第2天均可正常行走，切口均愈合良好、未見感染。觀察組1只大鼠術后出現術肢持續腫脹、膝關節活動受限。觀察組誘導膜組織中含有大量細胞，形成豐富血管網及平行于PMMA骨水泥塊的纖維組織；對照組誘導膜中所含血管明顯少于觀察組。兩組截骨斷端對位、對線均良好，鋼板及螺釘均在位、無松脫。結論成功建立了用于研究Masquelet誘導膜的SD大鼠股骨實驗模型。

骨缺損；誘導膜；Masquelet技術；大鼠

嚴重創傷、骨感染、慢性骨髓炎、骨不連、骨腫瘤保肢節段性切除等各種原因均可導致大段骨缺損。大段骨缺損治療難度大，帶血管腓骨移植、外支架骨搬運、自體髂骨移植等傳統治療方法均有不足[1～4]。2000年法國醫生Masquelet提出了“誘導膜”的概念即誘導膜技術，該技術是在骨缺損處填充PMMA骨水泥塊，4～6周骨水泥塊周圍形成誘導膜后，取出填充物植骨，有望應用于治療大段骨缺損[5]。為深入研究誘導膜技術用于治療負重肢體骨缺損的可行性，建立精確、可重復性強的實驗模型至關重要。國內文獻對誘導膜實驗模型報道甚少，國外文獻亦鮮有關于誘導膜模型精確截骨的描述。我們于2016年10月進行本研究，擬建立一種用于研究Masquelet誘導膜的SD大鼠股骨實驗模型。現將制模過程及結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物：SPF級成年雄性SD大鼠24只，鼠齡 8～10周，體質量260～280 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(粵)2013-0020。大鼠分籠飼養，4只/籠，溫度24～26 ℃，相對濕度50%～70%，光照時間晝14 h、夜10 h，自由進水及飲食，1周后用于實驗。②器材：自制不銹鋼大鼠股骨截骨導板及自制不銹鋼6孔鋼板(圖1)，1.5 mm皮質骨自攻螺釘(江蘇蘇州悅來醫療器械有限公司)、0.42 mm超細金剛砂鋸條(河北唐山鑫誠五金機電有限公司)，定制 0.5 mm克氏針(天津希翼瑞豐醫療器械有限公司)，JJ-12J組織脫水機、JB-P5生物組織包埋機(武漢俊杰電子有限公司)，Leica Autostainer XL自動染色機(Leica Biosystems，德國)，Nikon Eclipse CI正置光學顯微鏡(Nikon，日本)。

注：A為截骨導板，長15.37 mm、寬6 mm、高6 mm、厚1 mm，凹槽深5 mm；B為6孔鋼板，長22.5 mm、寬3.5 mm、厚1 mm。

圖1自制大鼠股骨鋼板及截骨導板

1.2 動物分組及處理 將大鼠隨機分為觀察組和對照組，每組12只。兩組禁食24 h、不禁水， 5%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.8 mL/100 g)；取左側臥位，右腿備皮，75%乙醇消毒術區；股骨外側皮膚縱行切口，切開皮膚及筋膜，于股外側肌及股二頭肌肌間隙進入，鈍性分離，自股骨大轉子至股骨髁顯露股骨外側面；放置6孔不銹鋼鋼板，調整好位置，使其位于股骨外側面中心，遠近端各鉆入兩枚克氏針臨時固定；將第2、5兩孔的克氏針穿過截骨導板孔后放置截骨導板于鋼板上方，助手用兩把彎鉗固定導板并維持股骨位置，將線鋸穿過導板凹槽分別行遠近端截骨至股骨高度2/3，不完全截斷；拔出第1孔的克氏針，鉆孔，螺釘固定，第6孔同前；取出截骨導板，再拔出第2孔的克氏針，鉆孔，螺釘固定，第5孔同前；鋼板完全固定后，重復上述步驟將股骨遠近端完全截斷，取出4 mm骨塊。將兩根1-0絲線穿過鋼板第3、4孔，觀察組在骨缺損區卡入PMMA骨水泥塊，絲線捆綁固定防止骨水泥塊移位，對照組不放置骨水泥塊。生理鹽水沖洗術區，采用強生 4-0Vicryl可吸收縫線依次縫合肌肉、深筋膜，1-0 絲線縫合皮膚。術后連續5天每日給予青霉素(青霉素鈉，華北制藥股份有限公司，160萬U/瓶，國藥準字 H13020655)8萬U肌內注以預防感染。術后禁水、禁食12 h，完全負重活動，單籠飼養4天至皮膚切口基本愈合后合籠。

1.3 相關指標觀察 ①一般情況：觀察兩組術后進食、排便、行走、切口愈合情況，統計術后4周內并發癥發生情況。②誘導膜組織病理學觀察：造模4周時分別采集觀察組PMMA骨水泥塊周圍及對照組截骨區的誘導膜組織，10%甲醛固定48 h，脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，組織切片機切取 5 μm厚薄片，常規HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學變化。③截骨斷端影像學表現：造模4周時對兩組術肢拍攝X線片，觀察截骨斷端對位情況以及鋼板、螺釘在位情況。

2 結果

2.1 兩組一般情況 兩組術后均能正常進食、排便，術后第2天均可正常行走，切口均愈合良好、未見感染。觀察組術后1只大鼠術肢持續腫脹、膝關節活動受限。

2.2 兩組誘導膜組織病理學改變 觀察組誘導膜組織中含有大量細胞，形成豐富的血管網及平行于PMMA骨水泥塊的纖維組織；對照組誘導膜中所含血管明顯減少。

2.3 兩組截骨斷端影像學表現 術后4周時兩組截骨斷端對位、對線均良好，鋼板及螺釘均在位、無松脫。

3 討論

目前，臨床治療節段性骨缺損的方法主要有帶血管腓骨移植、外支架骨搬運、自體髂骨移植等，但帶血管腓骨移植需局部顯微外科技巧、易損傷神經血管；外支架骨搬運治療周期長，易導致針眼感染、對接端骨不連；自體髂骨移植供區骨量有限，可導致感染、血腫形成等[1～4]。Moghaddam等[6]報道，誘導膜技術可用于治療大段骨缺損。但隨著Masquelet誘導膜技術的發展，暴露出骨源不足、骨爬行替代慢等問題；與骨組織工程技術有效結合可能是解決Masquelet誘導膜技術上述不足的途徑[6～8]。建立穩定的誘導膜動物模型是研究其應用的前提。既往報道的誘導膜動物模型存在截骨長度難掌控、固定物不牢靠、操作困難等問題[9,10]。故有必要建立一種穩定、操作簡單的誘導膜實驗模型。

能否做到精確至毫米的截骨是影響誘導膜模型制模效果的重要因素。目前多數研究采用SD大鼠建立誘導膜模型，但大鼠骨骼細小，做到精確截骨非常困難。傳統先用克氏針打孔再截骨的方法往往容易導致骨骼劈裂甚至造模失敗。本課題組自行設計了截骨導板，并與鋼板有效結合，截骨端非常整齊，范圍精確，且操作方法容易掌握。

既往研究中對誘導膜骨缺損模型固定的方法主要有鋼板、髓內釘、外支架、克氏針等[11～13]。Zhao等[13]采用單邊外支架成功制備了SD大鼠股骨極限骨缺損模型，經12周觀察未見松動跡象，認為這種外支架能為負重部位極限骨缺損的早期活動提供穩定性保證。但外支架可導致針眼感染、周圍組織激惹等并發癥；同時，大鼠負重時外支架中不同克氏針的應變將導致其周圍骨質承受不同的應力，一旦這種應力達到極限可能導致局部骨溶解，引起外支架松動。Wingerter等[14]對比鋼板和克氏針固定SD大鼠股骨臨界骨缺損模型的效果，造模4周拆除內固定物，組織學顯示克氏針組呈現出特有的纖維愈合模式，只有少量新生骨痂形成，固定的機械性不穩定引起微動是纖維愈合產生的原因；鋼板組出現自缺損遠近端向中心生長的自然內向性新生骨痂，源于鋼板固定的臨界骨缺損模型為骨愈合提供了穩定的愈合環境。有學者提出，髓內釘不適合固定大鼠的股骨骨缺損，原因是操作困難、抗旋轉差、易出現術中骨折及鎖釘失效等并發癥[15]。骨折周圍的機械微環境對骨折愈合非常重要，其決定了骨折愈合的方式。機械環境如軸向、剪切、骨碎片間微動對骨修復均有影響。Heiner等[16]研究了鋼板和髓內釘固定對SD大鼠股骨骨折愈合局部相關基因mRNA表達的影響，結果表明大部分生長因子、神經因子和造血因子等隨著骨折而出現mRNA表達改變。研究發現，髓內釘固定可明顯上調與軟骨、炎癥、細胞分化及乙酰膽堿相關的轉錄因子表達，鋼板固定則上調與巨噬細胞活性相關的轉錄因子表達[16]。

本研究采用鋼板固定誘導膜實驗模型。因為誘導膜組織在造模后第4周時新生血管活性最強，誘導膜中骨髓間充質干細胞(MSCs)含量最高，血管內皮生長因子(VEGF)、骨形態發生蛋白2(BMP-2)、TGF-β表達達到高峰[17～19]，故本研究在術后4周取材進行相關分析。結果顯示，術后4周X線顯示兩組鋼板、螺釘未見松動。HE染色顯示，觀察組形成有效的誘導膜組織；對照組形成的膜結構中僅見少量血管，觀察組則形成更為豐富的血管網，符合文獻報道的典型誘導膜結構[20]。由此可見該誘導膜實驗模型的建立方案是可行的。但在整個造模過程需要注意的事項較多；此外，大鼠股骨直徑較小，術中操作空間有限，鋼板螺釘固定時往往只有一次機會，所以要非常謹慎。術中需注意以下細節：①鋼板放置時近端要稍偏向內側，因外側大轉子非常薄，可供螺釘固定的長度非常短。②螺釘長度要合適，尤其是最近端及最遠端螺釘要足夠長，一般不少于7 mm。因近端可能會打中小轉子，且遠端靠近股骨髁為松質骨。③于遠端1/3分離肌肉間隙時注意保護血管。據文獻報道，大鼠此處有一恒定血管經過，損傷此血管可導致大量出血[10]。本研究觀察組有1只大鼠傷及此血管，術后出現大腿血腫、膝關節伸直受限。④麻醉藥物濃度不宜太高。本課題組早期預實驗采用10%水合氯醛麻醉，大鼠術后出現腸麻痹，改用5%水合氯醛麻醉未出現此并發癥，且麻醉效果滿意，亦未發生呼吸停止、死亡等。⑤術后前4天大鼠需分籠飼養，1只/籠，以防止互相撕咬引起傷口感染，待傷口穩定后合籠，建議4只/籠。經過不斷的完善實驗流程和總結經驗，本課題組已建立了一種相對成熟的大鼠股骨誘導膜造模方法，該方法具有以下優點：①因截骨導板的距離固定為4 mm，故截骨長度非常精確；②操作簡單，學習曲線短，手術時間短，對動物的損傷??；③材料價格低廉；④實驗動物術后麻醉清醒后即可完全負重活動。

綜上所述，本研究成功建立了用于研究Masquelet誘導膜的SD大鼠股骨實驗模型，該模型具有操作簡單、可重復性高、創傷小、易掌握、成本低等優點，可用于研發大段骨缺損治療藥物及生物材料。

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EstablishmentofratfemurexperimentalmodelforstudyingMasqueletinducedmembrane

ZENGZhikui1,HUANGFeng,HUANGPeizhen,LIYue,CAIQunbin,ZHOUQishi,JIANGZiwei,LIDing,ZHENGShengpeng

(1GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China)

ObjectiveTo establish an SD rat femur experimental model for studying the Masquelet induced membrane.MethodsA total of 24 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the observation group and control group, with 12 rats in each. A 4 mm bone block from the femur was removed in each of the two groups, and we used the steel plate to fix. The space was filled with PMMA cement spacers in the observation group, while in the control group, we did not do. The postoperative eating, defecation, walking, incision healing and complications were recorded. At 4 weeks after operation, the induced membrane tissues in the area around PMMA cement blocks of the observation group and in the osteotomy area of the control group were collected; HE staining was used to observe the histopathological changes; X-ray films were taken on the limbs of the two groups to observe the alignment of the osteotomy ends and the looseness of the steel plates and screws.ResultsIn both of the two groups, no rats had postsurgery symptoms of dysporia and eating disorder; rats walked normally on the second day after the surgery; no wound problem and infection were found. In the observation group, one rat's surgery limb had sustained swelling and knee movement restriction. In the observation group, the induced membrane was richly cellular, and the formation of large vascular network as well as bres oriented parallel to the PMMA could easily be identified. Histology analysis showed significantly decreased blood vessels in the control group. In the two groups, the steel plates and screws were in place with no loose.ConclusionsA SD rat femur experimental model for studying the induced membrane is successfully established.

bone defect; induced membrane; Masquelet technique; rats

國家自然科學基金資助項目(81603640)；廣東省中醫藥管理局項目(20161135)。

曾志奎(1984-)，男，博士研究生在讀，研究方向為中藥防治骨與關節損傷。E-mail： zengzhekui185@163.com

黃培鎮(1984-)，男，主治醫師，研究方向為骨與關節損傷。E-mail： 174635247qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.001

R683

A

1002-266X(2017)48-0001-04

2017-07-25)