一測多評法用于忍冬藤多成分含量測定的適用性研究

田偉 甄亞欽 王鑫國 田宇柔 李軍山 牛麗穎

摘要：目的 建立一測多評法同時測定忍冬藤中綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷6種成分含量的方法，并驗證該法在忍冬藤質量控制中應用的可行性與適用性。方法 以綠原酸為內參物，采用Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.4%磷酸，梯度洗脫，流速為1 mL/min，綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C檢測波長為327 nm，馬錢苷檢測波長為236 nm，柱溫35 ℃。結果 建立了忍冬藤中綠原酸與咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的相對校正因子；一測多評法的計算值與外標法實測值無明顯差異。結論 一測多評的質量控制模式可用于忍冬藤中6種不同成分的多指標同步質量評價。

關鍵詞：一測多評；相對校正因子；綠原酸；忍冬藤；質量評價

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.017

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）11-0077-06

Abstract： Objective To establish a QAMS method for content determination of six compositions （chlorogenic acid， caffeic acid， cryptochlorogenin acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C and loganin） from Lonicerae Japonicae Caulis； To verify the feasibility and applicability of this method in quality control of Lonicerae Japonicae Caulis. Methods Chlorogenic acid was set as internal reference substance. The HPLC analysis was performed on a Waters Symmetry C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） with a mobile phase consisted of acetonitrile and 0.4% phosphoric acid solution in gradient elution manner at a flow rate of 1 mL/min. The column temperature was maintained at 35 ℃， and the detection wavelength was set at 327 nm for chlorogenic acid， caffeic acid， cryptochlorogenin acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C and 236 nm for loganin. Results The relative correction factors of caffeic acid， cryptochlorogenin acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C and loganin were established； there was no obvious difference between calculated value of QAMS and measured value of external standard method. Conclusion The quality control mode of QAMS can be used for multi-index synchronization quality evaluation of the six compositions from Lonicerae Japonicae Caulis.

Keywords： QAMS； relative correction factors； chlorogenic acid； Lonicerae Japonicae Caulis； quality evaluation

忍冬藤為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥莖枝，具有清熱解毒、疏風通絡功效，用于溫病發熱、熱毒血痢、癰腫瘡瘍、風濕熱痹、關節紅腫熱痛[1]。忍冬是我國傳統藥用植物，具有抗菌、抗炎、調節免疫、抗氧化等多種藥理作用[2]。《本草綱目》云：“忍冬，莖葉同花，功用皆同。”金銀花是忍冬的干燥花蕾或帶初開的花，在中藥制劑、茶飲、保健品等領域應用廣泛，因需求量大，出現供不應求的現狀。忍冬藤資源豐富、價格便宜，具有良好的開發前景。

忍冬藤含有有機酸、環烯醚萜苷、黃酮等多類成分[3-4]，2015年版《中華人民共和國藥典》僅將馬錢苷和綠原酸作為忍冬藤的含量測定指標成分，不能完全反映該藥材的真實品質。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）是利用中藥中有效成分函數關系和比例關系，通過測定1個有效成分（性質穩定且易得到的對照品）實現多個成分（性質不穩定且難得到的對照品）的同時測定，該方法快速、簡便，是一種符合中藥多成分特點的多指標質量評價模式，已廣泛應用于中藥的質量控制中[5]。為了對忍冬藤進行多指標控制，本研究以綠原酸為內參物，對咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷QAMS同步測定的可行性與適用性進行探討與評價。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀，包括LC-15C泵、SPD-15C型紫外檢測器、SIL-10AF自動進樣器、CTO-15C柱溫箱、島津LC色譜工作站；美國賽默飛公司Ultimate 3000高效液相色譜儀，包括低壓三元梯度泵、自動進樣器、DAD檢測器、變色龍色譜工作站；沃特世e2695高效液相色譜儀，包括低壓四元梯度泵、自動進樣器、2489紫外檢測器、Empower 3色譜工作站；色譜柱為Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Wondasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；電子天平（TB-215D，德國賽多利斯）；KQ-250E超聲波清洗器（昆山市超聲儀有限公司）。

綠原酸對照品（批號PY20170216，純度99.96%）、隱綠原酸對照品（批號PY20170224，純度99.79%）、異綠原酸C對照品（批號PY20170303，純度91.88%）、馬錢苷對照品（批號PY20170108，純度99.31%），南京普怡生物科技有限公司；咖啡酸對照品（批號110885-200102，純度100.00%）、異綠原酸A對照品（批號111782-201405，純度92.00%），中國食品藥品檢定研究院，乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

20批忍冬藤樣品中15批由神威藥業集團有限公司提供，另5批分別購自石家莊樂仁堂、新興藥房、德濟堂、梔子藥房、百醫堂，經河北省藥品檢驗研究院孫寶惠主任中藥師鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥莖枝，編號為1～20。

2 方法與結果

2.1 分析方法的建立和驗證

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫（0～30 min，7%A；30～32 min，7%～10%A；32～44 min，10%A；44～50 min，10%～21%A；50～60 min，21%～34%A；60～65 min，34%A）；流速1 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長：綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C為327 nm，馬錢苷為236 nm；進樣量10 ?L。色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷對照品適量，加50%甲醇制成濃度分別為0.097 9、0.020 6、0.007 5、0.054 4、0.021 3、0.169 8 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取忍冬藤粉末（過3號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 線性關系考察

分別精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液2、4、6、10、15、20 ?L注入液相色譜儀，測定綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品進樣量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表1。綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷6種成分在相應范圍內呈良好線性關系。

2.1.4.2 精密度試驗

精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液10 ?L，連續進樣6次，計算綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的峰面積RSD分別為0.23%、0.28%、0.42%、0.23%、0.10%、0.18%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、10、16 h進樣10 ?L，測得綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的峰面積RSD分別為1.85%、1.68%、1.57%、1.91%、1.66%、1.08%，表明供試品溶液在16 h內穩定。

2.1.4.4 重復性試驗

取同一批號忍冬藤樣品6份，每份約1 g，精密稱定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別測定綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的峰面積，計算含量的RSD分別為1.56%、1.08%、1.27%、1.46%、1.17%、0.83%，表明本方法重復性良好。

2.1.4.5 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品粉末9份，每份約0.5 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，分別按各成分含量的80%、100%、120%精密加入綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的對照品貯備液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率及RSD，結果見表2～表7。表明本方法的準確度良好。

2.2 相對校正因子的確定

2.2.1 相對校正因子的計算

取“2.1.2”項下混合對照品溶液，分別進樣2、6、10、16、20 ?L，計算各相對校正因子。fk/m=fk/fm=Wk×Am/（Wm×Ak），式中，Ak為內標物峰面積，Wk為內標物質量，Am為組分m的峰面積，Wm為組分m的質量。以綠原酸為內標物，分別計算咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷的相對校正因子，結果見表8。

2.2.2 相對校正因子重現性考察

按相對校正因子測定條件和方法，分別采用3種不同的色譜儀和3種色譜柱測定，并計算綠原酸對咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷的fk/m，計算平均值，結果見表9。

2.2.3 待測色譜峰定位

采用不同色譜儀及色譜柱，待測組分的保留時間會有所波動，在色譜峰定位中一般采用相對保留時間或保留時間差法[6-8]。取“2.1.2”項下混合對照品溶液，分別采用3種不同色譜儀和3種色譜柱測定，并計算綠原酸對咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷的相對保留時間（rk/m），結果見表10，RSD均小于5%，表明利用相對保留時間進行色譜峰的定位是可行的。

2.2.4 一測多評法與外標法測定結果比較

首先采用外標法（extermal standard method，ESM）對忍冬藤中綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷進行多成分同步定量測定，再用建立的QAMS方法計算咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷的質量。Wm=Wk×Am/（fk/m×Ak），式中，Ak為內標物峰面積，Wk為內標物進樣量（質量），Am為組分m峰面積，Wm為組分m的質量。

每批樣品分別用2種方法平行測定2次，將2種方法的結果進行比較，以驗證QAMS用于忍冬藤中不同成分含量測定的可靠性，結果見表11。2種方法測得的忍冬藤中各成分含量無明顯差異，RSD均小于5%，提示建立的方法具有較好的可信度。

3 討論

本試驗采用雙波長模式同時測定忍冬藤中6種化學成分，其中，綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C的檢測波長為327 nm，馬錢苷的檢測波長為236 nm。馬錢苷在327 nm波長處無吸收，綠原酸等有機酸雖然在236 nm波長處有吸收，但分離易受忍冬藤中其他環烯醚萜苷類成分的影響，因此，采用雙波長模式同時測定，可以克服單一波長測定時信息量不足的缺點，使每個待測成分色譜峰均可以最大峰面積覆蓋圖譜。目前，QAMS方法多采用單一波長測定中藥中同一類成分的含量[9-10]。本研究結果表明，QAMS方法同樣適用于雙波長模式和多類成分的同時測定。

綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷在忍冬藤中含量較大，生物活性較高，因此將此6種成分作為忍冬藤質量評價的指標。其中，綠原酸化學性質穩定且廉價易得，作為內標物，建立其與咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的相對校正因子，在不同液相色譜系統與色譜柱中RSD均小于5%，符合測定要求。故選擇綠原酸為內標物，以降低檢測成本。

本試驗采用3套液相色譜系統進行色譜峰定位的重現性考察。雖然在不同色譜儀和不同色譜柱中相對保留時間的RSD均小于5%，但在同一色譜儀中色譜峰定位更為準確。在島津HPLC儀中，3種色譜柱綠原酸與異綠原酸C相對保留時間的RSD為0.66%，在賽默飛HPLC儀中，3種色譜柱綠原酸與異綠原酸C相對保留時間的RSD為1.36%；在沃特世HPLC儀中，3種色譜柱綠原酸與異綠原酸C相對保留時間的RSD為0.66%。而賽默飛HPLC儀與沃特世HPLC儀計算的RSD為1.94%，3臺HPLC儀計算的RSD則達到3.25%。這與3套液相色譜系統流動相的混合方式不同有關，島津液相色譜系統是二元高壓梯度，賽默飛和沃特世液相色譜系統是低壓梯度，流動相混合的位置與精度有一定差異，梯度變化時的時間延遲也不相同，從而導致色譜峰定位上的差別。因此，在建立QAMS方法時應注意此問題。

本試驗以忍冬藤為研究對象，通過方法學確證、相對校正因子的確認與重現性考察、色譜峰的定位和QAMS準確性評價，對QAMS技術在忍冬藤中的適應性和應用可行性進行研究，結果表明，采用QAMS測得的各成分含量與ESM測定結果沒有明顯差異，具有較高的重現性、穩定性及可信度。此方法的建立為全面考察忍冬藤質量提供了參考方法，提示在缺少對照品的情況下，通過相對校正因子及色譜峰的定位計算含量，可以實現忍冬藤中6種成分的質量控制。該方法作為忍冬藤質量的一種有效評價方式，可為忍冬藤的質量評價提供參考和依據。

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