棉酚對糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病纖維化的影響

李秧秧，陳涵斌，徐菲菲，萬麗，陳國榮，陳壘，陳三妹，王蓉蓉

（1．溫州醫科大學附屬第一醫院 病理科，浙江 溫州 325015；2．溫州醫科大學附屬第一醫院 放化療科，浙江 溫州 325015；3．溫州醫科大學 第一臨床醫學院，浙江 溫州 325035；4．紹興文理學院醫學院護理系，浙江 紹興 312000）

棉酚對糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病纖維化的影響

李秧秧1，陳涵斌2，徐菲菲1，萬麗1，陳國榮1，陳壘3，陳三妹4，王蓉蓉1

（1．溫州醫科大學附屬第一醫院 病理科，浙江 溫州 325015；2．溫州醫科大學附屬第一醫院 放化療科，浙江 溫州 325015；3．溫州醫科大學 第一臨床醫學院，浙江 溫州 325035；4．紹興文理學院醫學院護理系，浙江 紹興 312000）

目的：研究棉酚對糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）纖維化的影響及其可能機制。方法：雄性SD大鼠30只，隨機均分成3組：正常對照（NC）組、2型糖尿病（T2DM）組、棉酚治療（T2DMG）組。采用高脂飲食及低劑量鏈脲佐菌素（STZ）構建糖尿病大鼠模型，T2DMG組模型構建后用棉酚灌胃（15 mg·kg-1·d-1灌胃4周，再按每周15 mg·kg-1灌胃8周）。光鏡及電鏡下觀察肝組織形態學改變；Masson染色觀察肝組織纖維化病變；免疫組織化學檢測肝組織α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、11β-羥類固醇脫氫酶1（11β-HSD1）、糖皮質激素受體（GR）、核轉錄因子-κB（NF-κB）及轉化生長因子β1（TGFβ1）蛋白的表達；RT-PCR法檢測肝組織11β-HSD1、GR、NF-κB及TGFβ1 mRNA表達。結果：與NC組比較，T2DM組肝組織明顯纖維化，α-SMA、11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1蛋白表達明顯增多（P=0.001、0.004、0.001、0.001、0.002），GR、TGFβ1 mRNA表達明顯增加（P=0.01、0.001）；與T2DM組比較，T2DMG組肝纖維化病變明顯減輕，肝組織α-SMA、11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1蛋白表達明顯減少（P=0.009、0.031、0.002、0.009、0.027），11β-HSD1、GR、TGFβ1 mRNA表達明顯減少（P=0.003、0.038、0.014）。結論：棉酚可以有效改善NAFLD相關肝纖維化病變，其機制可能是抑制肝臟11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1的表達。

肝纖維化；糖尿病；棉酚；11β-羥類固醇脫氫酶1；糖皮質激素受體；核轉錄因子-κB；轉化生長因子β1

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是常見的糖尿病并發癥。在NAFLD的發病過程中，高糖致線粒體內超氧陰離子（O2-）產生過多，組織細胞內發生氧化應激，使肝星形細胞（hepatic stellate cell，HSC）激活，促進肝臟纖維化損傷。炎癥反應啟動及調節的關鍵因子核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）與轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）可相互協同，在NAFLD肝纖維化過程中起重要作用。棉酚（gossy-pol）是一種黃色多酚羥基雙萘醛類化合物，是錦葵科植物草棉、樹棉或陸地棉成熟種子、根皮中提取的一種多元酚類物質，為11β-羥類固醇脫氫酶1（11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1，11β-HSD1）抑制劑，可顯著抑制大鼠、豚鼠以及人的11β-HSD1[1]，有效改變脂質過氧化代謝動力學[2]及拮抗肺纖維化[3]。本課題組前期研究證實棉酚可有效減輕胰島素抵抗，降低糖尿病大鼠的血糖、血脂水平[4]。本研究通過觀察棉酚對2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠NAFLD肝纖維化及11β-HSD1、糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）、NF-κB、TGFβ1表達的影響，為糖尿病相關肝臟纖維化損傷的防治提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 模型復制與處理 雄性SD大鼠30只，體質量140～180 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（浙）2015-0004。隨機均分成3組：正常對照（NC）組、2型糖尿病（T2DM）組、棉酚治療（T2DMG）組。后2組通過高脂飲食建立T2DM大鼠模型，按文獻[5]進行。NC組腹腔注射等容積0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液。T2DMG組按15 mg·kg-1·d-1劑量棉酚灌胃4周，后以每周15 mg·kg-1劑量繼續棉酚灌胃8周（棉酚+2%羧甲基纖維素，棉酚由美國洛克菲勒大學葛仁山教授惠贈）。T2DM組、NC組給予等容積的2%羧甲基纖維素灌胃，次數及時間同T2DMG組。實驗期間T2DM組與T2DMG組持續供給高脂飲食，NC組供給普通飲食，實驗結束后處死大鼠。

1.2 HE染色及評分標準[6]取新鮮肝組織1塊（約10 mm×10 mm×2 mm），4%甲醛固定，脫水，透明，浸蠟及石蠟包埋，切片（厚度3 μm），HE染色及封固。NAFLD病變程度評分標準：①脂肪變性程度：隨機選10個低倍視野（×100），0分為無脂肪變性，1分為脂肪變性范圍＜33%，2分為脂肪變性范圍33%～66%，3分為脂肪變性范圍＞66%；②肝細胞小葉內炎癥及匯管區炎癥程度：隨機選10個高倍視野（×200），0分為無炎癥細胞，1分為炎癥細胞1～2個，2分為炎癥細胞2～3個，3分為炎癥細胞≥4個。

1.3 Masson三色法及評分標準[6]各組肝組織切片、脫蠟、蘇木素染色、分化，Masson液中染色5 min后水洗，亮綠液染色1 min，脫水，過石碳酸二甲苯，透明封固。結果判定：肝細胞呈紅色，膠原纖維呈藍綠色。纖維化評分：隨機選擇10個低倍鏡視野（×100），0分為無纖維化，1分為肝小葉3區竇周或肝細胞外纖維化，2分為匯管區出現纖維化，3分為肝小葉纖維化與匯管區纖維化相互連接，形成橋接纖維化，4分為肝硬化（典型的假小葉出現）。

1.4 肝臟超微結構檢查 取新鮮肝組織1小塊（1 mm×1 mm×1 mm），即刻入2.5%戊二醛4 ℃固定，鋨酸后固定，PBS漂洗及脫水。包埋及半薄切片定位后切片、行鉛鈾雙重染色后電鏡下觀察（德國萊卡公司RM2245型石蠟切片機，日本日立公司H-7500型透射電鏡機）。

1.5 免疫組織化學染色 各組肝組織切片后按Envision二步法染色。α-SMA、NF-κB為鼠單抗（稀釋濃度為1：100），11β-HSD1、GR、TGFβ1為兔多抗（稀釋濃度1：100）。結果判定：α-SMA、11β-HSD1、TGFβ1細胞胞漿顯示棕黃色為陽性表達；GR細胞胞核顯示棕黃色為陽性表達；NF-κB表達出現細胞漿陽性表達并出現核轉位，發生細胞核表達為陽性表達。隨機選擇5個低倍鏡視野（×100），應用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件計算11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1累積光密度。按下列評分標準評估α-SMA的表達[7]：0分為無著色，1分為輕度（＜10%），2分為中度（11%～25%），3分為重度（26%～50%），4分為極重度（＞50%）。

1.6 RNA提取及RT-PCR 3組各取100 mg肝組織加1 mL Trizol（美國Invitrogen公司），提取大鼠肝組織的總mRNA。取2 μg總mRNA，用M-MLV反轉錄酶（美國Promega公司）合成cDNA（20 μL）。取1 μL cDNA為模板，在Taq DNA聚合酶（大連寶生物公司）催化下行肝臟11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1基因mRNA擴增（引物由上海Invitrogen公司合成）。PCR引物及反應條件見表1，用Gel-pro31凝膠分析系統進行分析，以目的基因和內參照RPS16基因的累積吸光度比值作為目的基因的相對水平。

表1 PCR引物及反應條件

1.7 統計學處理方法 用SPSS20.0統計軟件進行分析。正態分布數據以 ±s表示，用單因素方差分析比較組間差異。偏態分布數據以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下形態學改變

2.1.1 HE染色：NC組肝小葉結構清晰，肝索整齊；T2DM組肝小葉結構紊亂，肝細胞明顯水腫伴脂肪變性，并可見多灶區細胞點狀壞死，伴小膽管增生及慢性炎細胞浸潤；T2DM組脂肪變性、小葉間炎癥、匯管區炎癥與NC組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。T2DMG組與T2DM組比較，脂肪變性、小葉間炎癥、匯管區炎癥稍改善，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

2.1.2 Masson染色：NC組肝組織散在綠染的膠原纖維，均表達于血管壁，T2DM組膠原纖維明顯增生，T2DMG組膠原纖維增生與T2DM組比較明顯減輕。T2DM組與NC組纖維化評分比較差異有統計學意義（P=0.001），T2DMG組與T2DM組比較差異有統計學意義（P=0.035），見圖2、表2。

圖1 各組肝組織的病理變化（HE，×400）

表2 各組大鼠肝組織脂肪變性、小葉間炎癥、匯管區炎癥、纖維化、α-SMA評分（n=10， ±s）

2.2 電鏡下形態學改變 NC組肝細胞核圓形居中，胞漿內線粒體、粗面內質網豐富，未見脂滴；T2DM組肝細胞核固縮偏位，線粒體減少、體積變小、密度增加，粗面內質網數目減少，胞漿內可見大量脂滴，狄氏竇膠原纖維增生，HSC明顯增生；T2DMG組肝細胞線粒體數目稍增多、密度稍降低，板狀嵴變清晰，胞漿內脂滴稍減少，粗面內質網數量與NC組相近，狄氏竇未見明顯膠原纖維及HSC增生。見圖3。

2.3 免疫組織化學染色結果 NC組肝組織未見α-SMA陽性表達的HSC，T2DM組肝組織內α-SMA陽性表達明顯增多，與NC組比較差異有統計學意義（P=0.001），T2DMG組α-SMA表達陽性減少，與T2DM組比較差異有統計學意義（P=0.009），見表2。NC組11β-HSD1、TGFβ1細胞漿呈弱陽性表達，GR細胞核呈弱陽性表達，NF-κB細胞漿弱表達；T2DM組11β-HSD1、TGFβ1細胞漿表達明顯增強，GR細胞核表達明顯增強，NF-κB細胞漿表達增強且出現胞核表達，與NC組比較差異均有統計學意義（P=0.004、0.002、0.001、0.001）；T2DMG組11β-HSD1、TGFβ1細胞漿表達明顯減弱，GR細胞核表達明顯減弱，NF-κB細胞漿表達減弱，個別胞核弱表達，與T2DM組比較差異均有統計學意義（P=0.031、0.027、0.002、0.009），見表3。

2.4 mRNA表達結果 T2DM組肝組織GR、TGFβ1基因mRNA表達明顯高于NC組（P=0.01、0.001）；11β-HSD1、NF-κB mRNA表達差異無統計學意義（P=0.443、0.438）。T2DMG組11β-HSD1、GR、TGFβ1 mRNA表達明顯低于T2DM組（P=0.003、0.038、0.014），NF-κB mRNA表達差異無統計學意義（P=0.431），見表3。

3 討論

圖2 各組肝組織纖維化病變（Masson染色，×100）

圖3 3組大鼠肝組織超微結構（TEM）

表3 各組大鼠肝組織11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1蛋白及mRNA表達水平比較（n=10， ±s）

NAFLD是常見的糖尿病并發癥，伴隨肝臟纖維化加重可進展為不可逆轉的肝硬化甚至肝功能衰竭，導致NAFLD病死率上升[8]，因此，有效地治療NAFLD具有重要的臨床意義。11β-HSD1為糖皮質激素（glucocorticoid，GC）的代謝酶，具有氧化/還原兩種活性，在肝臟內11β-HSD1主要以還原形式存在，可將無活性的皮質酮轉化為有活性的皮質醇，增強GC的作用。GR屬于保守的核受體超家族中的一員，大多數已知的GC的作用都是由GR介導。GC與GR結合，使糖異生的限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和葡萄糖6磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）表達上調，加速糖異生的過程，對抗胰島素的活性并使血糖升高。本課題組前期研究發現棉酚可有效改善胰島素抵抗，降低糖尿病大鼠的血糖水平[4]，本研究發現T2DM大鼠肝組織11β-HSD1、GR蛋白表達明顯增強，GR mRNA水平明顯升高，提示糖尿病時11β-HSD1表達上調使GC的活性增強。經棉酚治療后，11β-HSD1、GR蛋白表達及mRNA水平表達明顯減少，提示棉酚可能通過抑制肝11β-HSD1，使肝臟局部的GC活性減弱，從而抑制糖異生作用，降低血糖。

NF-κB作為激活炎癥反應啟動及調節的關鍵因子，可誘導TNF-α、白細胞介素、黏附分子等的表達，對肝臟炎癥后的纖維化病變起著重要作用[9]。在靜息的細胞中，NF-κB和IκB形成復合體，并以無活性形式存在于胞漿中。當細胞受細胞外信號刺激后，IκB激酶復合體（IκB kinase，IKK）活化，將IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位點并使游離的NF-κB迅速移位到細胞核（核轉位）并激活炎癥反應[10]。TGFβ1是最強的致肝纖維化細胞因子之一，它通過Smad或MAPK/ERK通路促進HSC增殖及活化[11]。HSC位于肝竇周隙內，正常情況下HSC處于靜止狀態，當機體出現氧化應激時可引起該細胞活化，導致α-SMA表達增多，加速合成細胞外基質（extracellular matrix，ECM）并促進肝纖維化。在肝臟損傷及炎癥反應過程中，TGFβ1分泌增多導致HSC活化，活化的HSC數量增多又可使TGFβ1分泌增多，兩者相互作用維持HSC進一步活化，最終導致肝臟纖維化。此外，大量的TGFβ1產生可激活ERK通路信號轉導，導致NF-κB轉位入核，發揮更強的炎癥作用[12]。本研究發現T2DM大鼠肝組織出現NF-κB蛋白胞漿表達增強并出現個別細胞核轉位，TGFβ1蛋白表達明顯增強，HSC明顯增生；經棉酚治療后，NF-κB蛋白表達量減弱伴個別細胞核表達，TGFβ1蛋白表達及mRNA水平明顯降低，HSC明顯減少，提示棉酚一方面可能通過降低血糖使氧化應激作用減弱，間接抑制NF-κB、TGFβ1的表達，另一方面通過抑制肝NF-κB核轉位、協同抑制TGFβ1蛋白表達，兩者共同減弱HSC的激活，從而減少肝內膠原纖維的合成，改善肝纖維化病變。

[1] PENG K, PAN Y, LI J, et al. 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 (11β-HSD1) mediates insulin resistance through JNK activation in adipocytes[J]. Sci Rep, 2016, 6：37160.

[2] JANERO D R, BURGHARDT B. Protection of rat myocardial phospholipid against peroxidative injury through superoxide-(xanthine oxidase)-dependent, iron-promoted Fenton chemistry by the male contraceptive gossypol[J]. Biochem Pharmacol, 1988, 37(17)： 3335-3342.

[3] KOTTMANN R M, TRAWICK E, JUDGE J L, et al. Pharmacologic inhibition of lactate production prevents myofibroblast differentiation[J]. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol, 2015, 309 (11)： L1305-1312.

[4] CHEN G, WANG R, CHEN H, et al. Gossypol ameliorates liver fibrosis in diabetic rats induced by high-fat diet and streptozocin[J]. Life Sci, 2016, 149： 58-64.

[5] 陳四梅, 張森凱, 劉網網, 等. 姜黃素衍生物L6H4對糖脂代謝異常大鼠的治療作用及其機制[J]. 溫州醫科大學學報, 2015, 45(3)： 176-179.

[6] FARRELL G C, CHITTURI S, LAU G K, et al. Guidelines for the assessment and management of non-alcoholic fatty liver disease in the Asia-Pacif i c region： executive summary[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2007, 22(6)： 775-777.

[7] TOBLLI J E, FERDER L, STELLA I, et al. Enalapril prevents fatty liver in nephrotic rats[J]. J Nephrol, 2002, 15(4)：358-367.

[8] COUTINHO E M, ATHAYDE C, ATTA G, et al. Gossypol blood levels and inhibition of spermatogenesis in men taking gossypol as a contraceptive. A multicenter, international,dose-f i nding study[J]. Contraception, 2000, 61(1)： 61-67.

[9] TESSARI P, CORACINA A, COSMA A, et al. Hepatic lipid metabolism and non-alcoholic fatty liver disease[J]. Nutr Metab Cardiovas, 2009, 19(4)： 291-302.

[10] MANNA P, DAS J, GHOSH J, et al. Contribution of type 1 diabetes to rat liver dysfunction and cellular damage via activation of NOS, PARP, IκBα/NF-κB, MAPKs, and mitochondria-dependent pathways： prophylactic role of arjunolic acid[J]. Free Radic Biol Med, 2010, 48(11)： 1465-1484.

[11] PARDALI E, GOUMANS M J, TEN DIJKE P. Signaling by members of the TGF-beta family in vascular morphogenesis and disease[J]. Trends Cell Biol, 2010, 20(9)： 556-567.

[12] WANG Y, ROUABHIA M, ZHANG Z. Pulsed electrical stimulation benefits wound healing by activating skin fibroblasts through the TGFβ1/ERK/NF-κB axis[J]. Biochim Biophys Acta, 2016, 1860(7)： 1551-1559.

Effect of gossypol on hepatic fibrosis of nonalcoholic fatty liver disease in diabetic rats

LI Yangyang1,CHEN Hanbin2, XU Feifei1, WAN Li1, CHEN Guorong1, CHEN Lei3, CHEN Sanmei4, WANG Rongrong1.
1.Department of Pathology, the First Aff i liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Radiation and Chemotherapy, the First Aff i liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou,325015; 3.The First Clinical Medical College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 4.Department of Nursing, School of Medical Sciences, Shaoxing University, Shaoxing, 312000

Objective： To investigate the effect of gossypol on nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) and its mechanism. Methods： Thirty male Sprague-Dawley rats were divided randomly into 3 groups： normal control(NC) group, type 2 diabetes mellitus (T2DM) group, type 2 diabetes mellitus treated with gossypol (T2DMG)group. After fed with a high-fat diet, the rats were injected with low-dose streptozotocin (STZ) intraperitoneally to induce type 2 diabetes mellitus. The T2DMG group were given 15 mg·kg-1·d-1gossypol by gavage for 4 weeks,followed by 15 mg·kg-1·d-1dose of gossypol every week for 8 weeks. The morphology of the liver was observed under light and transmission electronmicroscopy. Masson staining were used to observe the fi brosis of liver tissue.The protein expression of α-SMA, 11β-HSD1, GR, NF-κB and TGFβ1 were assayed by immunohistochemistry.The mRNA expression of 11β-HSD1, GR, NF-κB and TGFβ1 from rats livers were assayed by semi-quantitative RT-PCR. Results： Compare with NC group, T2DM group hapatic fi brosis was obvious, α-SMA, 11β-HSD1, GR,NF-κB and TGFβ1 protein expression was signif i cantly enhanced (P=0.001, 0.004, 0.001, 0.001, 0.002), GR and TGFβ1 mRNA expression was significantly increased (P=0.01, 0.001). Compare with T2DM group, T2DMG group liver fibrosis was significantly ameliorated, α-SMA, 11β-HSD1, GR, NF-κB and TGFβ1 expression was signif i cantly decreased (P=0.009, 0.031, 0.002, 0.009, 0.027), 11β-HSD1, GR and TGFβ1 mRNA expressionwas signi fi cantly reduced (P=0.003, 0.038, 0.014). Conclusion： Gossypol exerts the capacity to relieve hepatic fi brosis from NAFLD, inhibiting the expression of 11β-HSD1, GR and NF-κB, TGFβ1 may be involved in it.

liver fi brosis; diabetes mellitus; gossypol; 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1; glucocorticoid receptor; nuclear transcription factor-κB; transforming growth factor-β1

R363

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.11.002

2017-04-24

浙江省公益性技術應用研究計劃項目（Y2011c23123）；溫州市科技局科研基金資助項目（Y20120010，Y20130166）。

李秧秧（1986-），女，浙江溫州人，住院醫師。

王蓉蓉，副主任醫師，Email：997683344@qq.com。

丁敏嬌）