豬圓環病毒2d亞型病毒樣顆粒的制備

夏 葉，郭佳宏，廖學文，李春華，易建中，凌紅麗，蔣貽海，繆德年*

（1上海市農業科學院上海種豬工程技術研究中心，上海 201106；2青島蔚藍生物股份有限公司，青島 266001）

豬圓環病毒2d亞型病毒樣顆粒的制備

夏 葉1，郭佳宏1，廖學文1，李春華1，易建中1，凌紅麗2，蔣貽海2，繆德年1*

（1上海市農業科學院上海種豬工程技術研究中心，上海 201106；2青島蔚藍生物股份有限公司，青島 266001）

為了制備豬圓環病毒2d亞型病毒樣顆粒，根據GeneBank上公布的PCV2d亞型HB-MC1株的序列和大腸桿菌密碼子使用頻率表優化合成PCV2d亞型ORF2基因，克隆到原核表達載體pET30a（+），獲得重組表達質粒pET30a-Cap2d，將該質粒轉化入Rosetta（DE3）宿主菌，IPTG誘導表達。利用SDS-PAGE對目的基因的表達及產物的可溶性進行分析，利用Western blot和瓊脂凝膠免疫擴散試驗鑒定重組蛋白的免疫原性，并利用電鏡技術鑒定重組Cap2d蛋白形成的病毒樣顆粒。SDS-PAGE結果表明PCV2d的ORF2基因在大腸桿菌中得到了高效可溶性表達；電鏡下觀察超聲破碎后的上清中存在大量直徑約17 nm的病毒樣顆粒；Western blot和瓊脂凝膠免疫擴散試驗結果表明該可溶性蛋白可與豬PCV2陽性血清特異性結合，具有較好的免疫原性。本研究為制備PCV2d亞單位疫苗和相關檢測試劑盒奠定了基礎。

豬圓環病毒2d亞型；ORF2基因；可溶性表達；病毒樣顆粒

豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、增生性壞死肺炎（Proliferative necrotic pneumonia，PNP）等豬圓環病毒相關疾病（Porcine circovirusassociated disease，PCVAD）的主要病原［1］。目前，PCV2在世界各國普遍存在，在中國豬群中的流行也十分嚴重，給我國養豬業造成嚴重經濟損失，制約了養豬業的發展［2-3］。

PCV2可分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和 PCV2e等多個亞型［4］。2004年前 PCV2的流行毒株以PCV2a亞型為主，但近年來PCV2的流行趨勢逐漸由PCV2a亞型轉變為PCV2b亞型，且不斷有PCV2d和PCV2e兩種新亞型的出現［4］。Guo等［5］對分離于2004—2008年的19個PCV2分離株進行序列分析發現，2株屬于PCV2a亞型，14株屬于PCV2b亞型，3株屬于PCV2d亞型，且PCV2d亞型分離株不與中和單克隆抗體反應，揭示其抗原表位發生了變異。唐志玲等［6］對廣東省的5個分離毒株進行序列分析，其中3個毒株屬于PCV2b亞型，2個毒株為PCV2d亞型，報道稱PCV2b為中國目前流行豬圓環病毒病病原的主導亞型，確認了PCV2d作為一種新亞型在中國的存在。徐妮［7］對山東省的7個分離毒株進行序列分析，其中有6株屬于PCV2d亞型，1株屬于PCV2b基因亞型，發現PCV2d亞型處于主導地位，PCV2b亞型次之。Xiao等［8-9］對美國2011—2016年的分離毒株進行序列分析發現，2011—2013年PCV2b亞型占主導地位，檢測率均高于50%；2014—2016年PCV2d-2亞型的檢出率急劇上升，高達70%左右，而PCV2b亞型則逐年降低，目前已不足10%；最新發現的PCV2e亞型［10］近年的檢出率均維持在較低水平（＜10%）。上述研究說明我國乃至全球PCV2出現了由PCV2b亞型向PCV2d亞型轉向的流行態勢，這為未來豬圓環病毒疫苗的研制指明了方向。

PCV2疫苗在一定程度上有效控制了PCV2的感染，顯著降低了PCV2感染豬群的臨床癥狀，提高了豬的生長性能。目前市場上主要有滅活疫苗和亞單位疫苗兩種商品化的PCV2疫苗［11］。滅活疫苗主要有法國梅里亞公司的CIRCOVAC?、上海海利生物藥業有限公司的LG株疫苗、四川省華派生物制藥有限公司的ZJ/C株疫苗、武漢科前動物生物制品有限公司的WH株疫苗和洛陽普萊柯生物工程有限公司的SH株疫苗等。亞單位疫苗主要有美國勃林格公司利用桿狀病毒生產的Ingelvac?CIRCOFLXTM、荷蘭英特威公司的Circumvent?和Porcillis?PCV、武漢中博生物股份有限公司［桿狀病毒載體滅活疫苗（CP08株）］、青島易邦生物工程有限公司的圓環基因工程亞單位疫苗“易圓凈”。現有疫苗大多基于PCV2a或PCV2b亞型，尚未有基于PCV2d亞型的疫苗上市。鑒于我國乃至全球由PCV2b亞型向PCV2d亞型轉向的流行態勢，開展基于PCV2d亞型疫苗的研究具有重要意義［12］。

PCV2 ORF2編碼的病毒衣殼蛋白（Capsid protein，Cap）由230—231個氨基酸殘基組成，分子量約30 kDa，是PCV2主要的結構蛋白和免疫原性蛋白，其N端段富含堿性氨基酸的高度保守序列為核定位信號肽序列（Nuclear localization signal，NLS）［13-14］。利用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統所表達的Cap蛋白能自發組裝成病毒樣顆粒（Virus-like particles，VLPs），可刺激機體產生強烈的免疫應答反應［15］。但作為獸用疫苗，利用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統來生產PCV2d亞型Cap蛋白，產量低成本高［12，15］。本研究旨在利用低成本的大腸桿菌表達系統高效表達PCV2d亞型Cap蛋白來制備病毒樣顆粒，為進一步開發商品化PCV2亞單位疫苗和檢測試劑盒奠定基礎，為有效防控PCV2d的感染和流行提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

pET30a（+）表達質粒購自Merck公司；E.coli Rosetta（DE3）宿主菌購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 主要試劑

Nde I、Hin d III限制性內切酶、PrimerSTAR?GXL DNA Polymerase、DNA Marker、蛋白分子量標準、異苯基硫代半乳糖苷（IPTG）等購自Takara公司；胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast extract）購自Oxoid公司；質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、預染蛋白Marker、增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒和卡那霉素購自北京天根生物科技有限公司；PVDF轉印膜（FluoroTrans?）購自美國PALL公司；PCV2陽性血清檢測試劑盒購自西班牙INGENASA公司、羊抗豬IgG購自Abcam?公司。其他試劑均為國產分析純產品。

1.3 原核表達載體的構建與鑒定

根據PCV2d亞型HB-MC1株基因組中ORF-2編碼的Cap蛋白氨基酸序列（GenBank登錄號：KM460 824.1），選用大腸桿菌偏愛密碼子設計Cap蛋白全基因堿基序列（CAI：0.85），并在其5’端引入Nde I酶切位點，3’端引入終止密碼子與Hin d III酶切位點，基因合成后經雙酶切克隆至pET30a（+）表達載體，獲得攜帶目的片段的陽性質粒命名為pET30a-Cap2d，轉化入E.coli Rosetta（DE3）宿主菌，挑取陽性菌落進行測序鑒定，將序列未發生突變和移碼的陽性重組菌株命名為pET30a-Cap2d/Rosetta。

1.4 重組菌的誘導表達及可溶性分析

挑取陽性重組單菌落，接種于含有20μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37℃條件下200 r/min振蕩培養過夜。將過夜培養物以1∶100的比例重新接種于含卡納霉素的LB培養基中，37℃200 r/min培養至OD600為0.6—0.8，加入終濃度為0.0002 mol/L的IPTG，30℃誘導培養6 h，10 000 r/min離心5 min收集菌體，PBS洗滌菌體1次，再次收集菌體后按初始培養基體積的1/5加入PBS懸浮細菌，在冰水浴中進行超聲波裂解。待菌體裂解完全后，4℃條件下12 000 r/min離心10 min，分別收集上清和沉淀，沉淀用與上清等體積的細菌裂解液混懸。分別取樣進行12%SDS-PAGE分析，檢測Cap蛋白的表達情況。

1.5 W estern blot分析

取誘導后重組菌破碎上清與上樣緩沖液預混后進行 SDS-PAGE電泳，電泳結束后，將凝膠中的蛋白恒壓100 V濕轉1 h至PVDF膜上，PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加入試劑盒中的PCV2陽性血清（1∶100稀釋）于4℃孵育過夜；TBST洗膜5次后，加入HRP標記的羊抗豬IgG（1∶5 000稀釋），37℃孵育1 h；TBST洗膜5次后，按增強型HRP-DAB試劑盒說明書顯色。

1.6 重組蛋白的純化

收集重組菌誘導表達上清液，加入飽和硫酸銨溶液，使其終濃度為10%，4℃放置30min后12 000 r/min離心15 min，收集上清，加入飽和硫酸銨溶液，使其終濃度為50%，4℃放置30 min后12 000 r/min離心15 min，棄上清，加入原體積1%的PBS重溶，利用非連續性蔗糖密度梯度離心來純化目的蛋白。蔗糖密度梯度依次為10%、15%、20%、25%、30%、35%以及40%，超速（25 000—30 000 r/min）離心分離1 h后，按0.5 mL/管小心吸取分離液，分別取樣進行12%SDS-PAGE分析，將純度較高的小管匯總到一起，取樣與標準BSA一起電泳，通過條帶分析軟件（Tanon Gis），計算Cap蛋白濃度。

1.7 瓊脂凝膠免疫擴散試驗

在瓊擴板上用七孔梅花形打孔器打孔。將制備的可溶性Cap2d蛋白濃縮液作為檢測抗原，用PBS倍比稀釋。中心孔加入豬抗PCV2陽性血清，周圍孔依次加入不同稀釋度的可溶性Cap2d蛋白。37℃溫箱中反應過夜，觀察結果。

1.8 病毒樣顆粒的電鏡觀察

電鏡觀察在上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所進行。取微量純化的Cap2d蛋白滴于銅網上，待液體被充分吸收后用2%的醋酸雙氧鈾染色1 min，待完全干燥后置透射電鏡下觀察VLPs形成情況。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體pET30a-Cap2d構建與鑒定

挑取單克隆，接種于LB液體培養基中擴大培養。提取質粒，用Nde I/Hin d III對質粒進行雙酶切。酶切后，重組質粒出現兩條片段，其中小片段約為720 bp，與預期片段大小相符；而未酶切對照組未出現小片段，表明目的基因成功插入表達載體pET30a中。測序結果表明，成功構建了重組表達載體pET30a-Cap2d（圖 1）。

2.2 重組菌pET30a-Cap2d/Rosetta誘導表達及可溶性分析

收獲誘導后菌體進行超聲波破碎，分別對超聲波破碎后上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，結果顯示重組菌pET30a-Cap2d/Rosetta經IPTG誘導后，在上清和沉淀中均出現一分子量約27 kD的特異性條帶，與預期結果相符，說明部分目的蛋白以可溶形式存在（圖2）。

2.3 表達產物的W estern blot分析

誘導后重組菌破碎上清經SDS-PAGE電泳（圖3-a），轉PVDF膜后，進行Western blot鑒定，在27 kD目的條帶大小位置出現一條明顯的印跡（圖3-b），表明本研究中誘導表達的Cap2d蛋白可被PCV2特異性多克隆抗體識別。

圖1 重組質粒pET30a-Cap2d的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant p lasm id pET30a-Cap2d by restriction enzyme digestion

圖2 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE of recombinant protein

2.4 Cap2d蛋白的純化

重組菌表達上清經硫酸銨沉淀、蔗糖密度梯度離心后，獲得了純度較高的Cap2d蛋白，經SDS-PAGE電泳（圖4）分析，純度可達90%以上，表達量達100 mg/L培養液。

圖3 重組蛋白的SDS-PAGE（a）和W estern blot（b）分析Fig.3 SDS-PAGE（a）and W estern blot（b）analysis of recombinant protein

M：蛋白質分子量標準；1：純化前上清；2：純化后Cap 2d蛋白

2.5 Cap2d蛋白的瓊脂凝膠免疫擴散試驗

瓊脂凝膠免疫擴散試驗結果顯示Cap2d蛋白能與PCV2陽性豬血清發生反應，出現沉淀線的最高稀釋度為1∶16（圖5），即本試驗所純化Cap2d蛋白的瓊擴效價為1∶16。

2.6 病毒樣顆粒的電鏡觀察

取微量純化的Cap2d蛋白進行電鏡觀察，結果顯示重組Cap2d蛋白能自發組裝成直徑約17 nm的PCV2 VLPs，與PCV2病毒粒子形態相似（圖6）。

圖5 瓊脂凝膠免疫擴散試驗Fig.5 Result of agar gel immunodiffusion

圖6 Cap2d蛋白形成VLPs的電鏡觀察（67 000×）Fig.6 Electron m icroscopic observation of Cap2d protein-formed VLPs（67 000×）

3 討論

近年來，PCV2已成為影響豬養殖業的重要病原之一，疫苗免疫是預防PCV2感染發病的主要手段。由于PCV2在細胞上增殖滴度低，由其制成的滅活疫苗需多次加強免疫才能達到預防效果。Nawagitgul等［14］和Fan等［15］分別將PCV2 ISU31株和Yu-A株的ORF2基因通過桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞Sf9中表達獲得30 kD的PCV2 Cap蛋白，電子顯微鏡觀察均發現純化的Cap蛋白可自裝配形成17 nm大小的病毒樣顆粒，且可與PCV2感染血清反應。Fan等［15］將含有重組桿狀病毒的細胞裂解產物與佐劑混合后免疫21日齡仔豬，激發了高水平的抗體。Martelli等［16］將利用桿狀病毒表達系統表達的PCV2 Cap蛋白制成亞單位疫苗，一個劑量即可誘導機體產生體液免疫和細胞免疫，并能有效保護豬體不發生PCVAD。利用重組桿狀病毒表達獲得的Cap蛋白能夠自我組裝形成衣殼樣粒子（Capsid-like particles）或稱病毒樣顆粒（Virus-like particles，VLPs）結構，因此成為當前商品化疫苗抗原的重要來源。目前美國勃林格公司的Ingelvac?CIRCOFLXTM、荷蘭英特威公司的Circumvent?和Porcillis?以及武漢中博生物股份有限公司的桿狀病毒載體滅活疫苗（CP08株）均系采用桿狀病毒表達系統制備亞單位疫苗。黃娟等［12］也采用該系統成功表達了PCV2d亞型的Cap蛋白，但SDS-PAGE和間接免疫熒光的結果均表明Cap蛋白在Sf9昆蟲細胞中的表達量較低，這也是目前PCV2亞單位疫苗價格較高的原因。

為降低成本，研究者開始利用大腸桿菌表達系統表達Cap蛋白來進行PCV2亞單位疫苗的研制，該疫苗的成本可比目前的進口疫苗降低約70%，比國產疫苗降低約50%。Trundova等［17］將全長或去除NSL序列的PCV2 ORF2基因插入載體pDest17，分別轉化入BL21（DE3）和BL21-CodonPlus（DE3）-RIPL感受態細胞。結果顯示，全長ORF2僅在BL21-CodonPlus（DE3）-RIPL中獲得表達，表達量為3 mg/L培養液；而去除NLS的ORF2在兩種感受態細胞中均獲得表達，獲得的重組Cap蛋白均可與PCV2豬陽性血清發生反應。祁艷華等［18］利用大腸桿菌表達系統表達得到了包涵體形式的全長Cap蛋白。孫偉等［19］表達了去除NLS的Cap蛋白，獲得可溶形式的表達，但不能形成VLPs。Marcekova等［20］通過截短ORF2基因、優化密碼子以及選擇具有較高含量稀有tRNA的BL21-CodonPlus（DE3）-RIPL細胞作為宿主菌等多種方法，最終獲得了可溶表達的重組Cap蛋白，但表達量較低且未能形成VLPs?？梢?，應用大腸桿菌表達系統表達Cap蛋白仍存在諸多問題。近期，趙曉云等［21］根據大腸桿菌密碼子使用頻率表優化合成PCV2 NJ株ORF2基因，插入原核表達載體pQZ1，通過BL21表達宿主菌實現了PCV2b亞型ORF2基因在大腸桿菌中的可溶表達，重組Cap蛋白體外組裝形成VLPs，在應用大腸桿菌表達系統制備病毒樣顆粒方面取得了突破。本研究通過優化密碼子、宿主菌、表達條件等多種策略的組合應用，首次實現了PCV2d ORF2基因在大腸桿菌中的高效可溶表達，表達量達100 mg/L培養液，且重組Cap蛋白能自發組裝成VLPs。Western blot與瓊脂凝膠免疫擴散試驗均表明，本研究得到的PCV2d Cap蛋白具有良好的免疫原性。后續將進一步開展PCV2d亞單位疫苗、檢測試劑盒的研制工作，為有效防控PCV2d的流行提供技術支撐。

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Preparation of porcine circovirus subtype 2d virus-like particles

XIA Ye1，GUO Jia-hong1，LIAO Xue-wen1，LIChun-hua1，YIJiang-zhong1，LING Hong-li2，JIANG Yi-hai2，MIAO De-nian1*

（1Shanghai Engineering Research Center of Breeding Pig，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201106，China；2Qingdao Vland Biotech Limited Company，Qingdao266001，China）

In order to prepare the virus-like particles of porcine circovirus subtype 2d（PCV2d），the ORF2 gene of PCV2d was optimally synthesized according to both Cap protein sequence of PCV2d HB-MC1 strain published by the GeneBank and codon usage of E.coli，and cloned into the prokaryotic expression vector pET30a（+）to get the recombinant expression plasmid pET30a-Cap2d，and then the plasmid was transformed into the host E.coli Rosetta（DE3）so as for the target gene to be expressed by IPTG induction.The target gene expression and the product’s solubility were analyzed by SDS-PAGE，the recombinant protein’s immunogenicity was identified by Western blot and agar gel immunodiffusion test，and the recombinant Cap2d protein-formed virus-like particles（VLPs）were confirmed by electronmicroscopy.The SDS-PAGE indicated that the ORF2 gene of PCV2d was efficiently and solubly expressed in E.coli Rosetta（DE3）.The electron microscopic observation showed that there were large numbers of the 17-nm VLPs in supernatant after ultrasonication.The Western blot and agar gel immunodiffusion test showed that the soluble protein could specifically bind the PCV2 positive serum and have good immunogenicity.The above results lay a foundation for developmentof PCV2d subunit vaccine and related testing kits.

Porcine circovirus subtype 2d；ORF2 gene；Soluble expression；Virus-like particles

2016-11-16

上海市市級農口系統青年人才成長計劃［滬農青字（2017）第1-17號］；上海工程技術研究中心建設專項（16 dz2250700）；上海市科委科研計劃項目（17140900302）

夏葉（1987—），女，博士，助理研究員，主要從事動物疫病防控技術研究。E-mail：xiayego＠163.com，Tel：021-62202519

*通信作者，E-mail：18918162235＠163.com

S859.79

A

1000-3924（2017）06-043-06

程智強）