卡瓦葉子的化學成分和細胞毒活性研究

楊建香

摘要：選取卡瓦（Piper methysticum Forst. f.）葉子為材料，通過多次硅膠柱層析、凝膠柱層析等方法對各個部位進行分離純化，然后借助于核磁共振氫譜、碳譜、質(zhì)譜等方法進行結構鑒定，最終從卡瓦葉子中分離出6種化合物，分別為desmethoxyyangonin、yangonin、11-methoxyyangonin、11-methoxy-5，6-dihydroyangonin、methysticin、dihydromethysticin。采用MTT法對6種化合物進行藥理活性測試，結果表明，Yangonin和11-methoxyyangonin對細胞A549（非小細胞肺癌）和細胞NCI-H460（人體肺癌細胞）有非常強的細胞毒活性，11-methoxy-5，6-dihydroyangonin、Methysticin、Dihydromethysticin對細胞A549和細胞NCI-H460則沒有明顯的細胞毒性。

關鍵詞：卡瓦（Piper methysticum Forst. f.）葉子；化學成分；細胞毒活性

中圖分類號：O629；R962 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）20-0093-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.20.021 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Taking leaves of Kava（Piper methysticum Forst. f.） as materials， six compounds were obtained from the EtOAc extract by a combination of column chromatography of silica gel，Sephadex LH-20 many times. Their structures were determined on the basis of 1HNMR，13C NMR，2DNMR，UV，IR，and ESIMS spectra data and were identified as Desmethoxyyangonin，yangonin，11-methoxyyangonin，11-methoxy-5，6-dihydroyangonin，methysticin，dihydromethysticin. The cytotoxicity of six compoundswas tested by MTT assay，the result showed that yangonin and 11-methoxyyangonin were very strong cytotoxicity against A549 and NCI-H460 cells，while，11-methoxy-5，6-dihydroyangonin，methysticin and dihydromethysticin were very weak cytotoxicity against A549 and NCI-H460 cells.

Key words： leaves of Kava （Piper methysticum Forst. f.）； chemical constituents； cytotoxicity

卡瓦胡椒（Piper methysticum Forst. f.）俗稱卡瓦（Kava or Kawa），是瓦努阿圖、斐濟、湯加及所羅門群島等南太平洋諸島野生的一種多年生胡椒科（Piperaceae）胡椒屬（Piper）灌木類植物[1，2]。該類植物株高約2～3 m，多變異；葉大，心形，寬大于長；不結子，其繁殖完全利用根插條或分根的人工無性繁殖；大多數(shù)太平洋島嶼均有栽培，以瓦努瓦圖島為最多。人工栽培史長達2 500～3 000年，但在夏威夷的山谷中曾發(fā)現(xiàn)野生的卡瓦胡椒。

卡瓦胡椒的根、莖和鮮葉有很好的藥用價值，有鎮(zhèn)靜催眠、抗菌殺蟲、抗痙攣、局部麻醉等作用，另外還可以治療驚厥、哮喘、焦慮癥、抑郁癥，對促進睡眠和提高睡眠質(zhì)量也有顯著療效，且毒副作用小[2-5]。卡瓦胡椒是全球10個中草藥中最暢銷的中草藥，目前也是歐美最暢銷的中草藥之一。當前關于卡瓦葉子中的化學成分研究很少，本試驗通過對卡瓦葉子中化學成分進行系統(tǒng)研究，結果從卡瓦葉子中分離得到6種化合物，通過一維、二維核磁波譜、質(zhì)譜等數(shù)據(jù)分析，鑒定出該化合物分別為desmethoxyyangonin、yangonin、11-methoxyyangonin、11-methoxy-5， 6-dihydroyangonin、methysticin和dihydromethysticin；采用MTT法對這6種化合物進行人類癌細胞株[A549（非小細胞肺癌），NCI-H460（人體肺癌細胞）]的增殖抑制活性測定，結果發(fā)現(xiàn)，化合物desmethoxyyangonin、yangonin、11-methoxyyangonin對細胞A549和細胞NCI-H460的半抑制濃度（IC50）小于50 μg/mL，尤其是化合物yangonin和11-methoxyyangonin有明顯的細胞毒性；化合物11-methoxy-5，6-dihydroyangonin、methysticin、dihydromethysticin對細胞A549和細胞NCI-H460的IC50大于50 μg/mL，沒有明顯的細胞毒性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 卡瓦葉子粉末由中國科學院華南植物園天然藥物實驗室提供。人肺癌細胞A549和NCI-H460均由廣州中醫(yī)藥大學熱帶醫(yī)學研究所饋贈。

1.1.2 試劑與儀器 提取用乙醇（95%為工業(yè)乙醇）；實驗中所用的化學試劑（正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等）均為分析純試劑，由廣州化學試劑廠生產(chǎn)；柱層析硅膠（100～200目、200～300目、300～400目）、柱層析反相硅膠Rp-C18（40 μm，60 μm）以及薄層硅膠層析板GF254均由青島海洋化工廠生產(chǎn)；柱層析用凝膠Sephadex LH-20由上海生物科技有限責任公司提供；旋轉蒸發(fā)儀型號為RE-2000A，由上海一凱儀器設備有限公司生產(chǎn)；SHZ-CD型循環(huán)水真空泵由鞏義市予華儀器有限責任公司生產(chǎn)。質(zhì)譜用VGAutospec-300型質(zhì)譜儀測定；核磁共振譜用BrukerAM-400核磁共振光譜儀測定，以TMS為內(nèi)標。

1.2 試驗方法

1.2.1 化合物的提取 用電子天平稱取已經(jīng)粉碎的卡瓦粉末5 kg，用工業(yè)乙醇反復多次回流提取，合并所有的回流提取液濃縮成浸膏，加入合適比例的水混懸，然后加入一定量的乙酸乙酯，反復多次萃取，合并萃取所得液體，繼續(xù)濃縮得一定量乙酸乙酯浸膏250 g。

1.2.2 化合物的分離 稱取柱層析硅膠（200～300目）500 g，加入乙酸乙酯浸膏中，然后再加入適量的乙酸乙酯攪拌均勻，放置在室溫下自然揮干，所得的揮干樣品進行硅膠柱層析，以正己烷和丙酮兩種混合溶劑梯度洗脫，再通過硅膠薄層層析板（TLC）跟蹤檢測，最終合并為3個餾分F1、F2和F3。

餾分F1（25 g）經(jīng)硅膠柱層析（200～300目），以正己烷/丙酮（100∶0～50∶50）梯度洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇）層析，得到化合物1（8.22 mg）。

餾分F2（20 g）經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚/丙酮（100∶0～50∶50）梯度洗脫得到2個餾分，分別為F2-1和F2-2。F2-1經(jīng)硅膠柱層析（300～400目），以石油醚/丙酮（100∶0～50∶50）梯度洗脫，所得餾分重結晶，得到化合物2（5.34 mg）。F2-2經(jīng)硅膠柱層析（300～400目），以正己烷/丙酮（100∶0～50∶50）梯度洗脫，所得餾分經(jīng)薄層層析板制備，得到化合物3（6.24 mg）。

餾分F3（40 g）經(jīng)硅膠柱層析（200～300目），以正己烷/丙酮（100∶0～0∶100）梯度洗脫，再經(jīng)薄層層析（TLC）跟蹤檢測，合并得到6個餾分。所得的6個餾分繼續(xù)經(jīng)硅膠柱層析（300～400目），反復多次層析，最終得到3種化合物，分別為化合物4（5.56 mg）、化合物5（6.18 mg）、化合物6（7.25 mg）。

1.2.3 抗腫瘤活性測試 采用MTT法[6]。在37 ℃下，收集對數(shù)生長期的腫瘤細胞以1×105個/mL的濃度接種于96孔板（100 μl/孔），5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細胞貼壁；然后吸去上清液，加入含試驗所需濃度樣品液的維持液，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；棄藥液，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；終止培養(yǎng)，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加DMSO（150 μL/孔），置于搖床上振蕩10 min，使結晶充分溶解，于酶標儀570 nm處測各孔吸光度。同時設置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)DMSO、培養(yǎng)液、MTT、DMSO）；計算細胞抑制率，細胞抑制率=[（對照-本底）-（給藥-本底）]/（對照-本底）×100%。

所得數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間比較用t檢驗，檢驗水準α為0.05，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0軟件完成。

2 結果與分析

2.1 各化合物的試驗數(shù)據(jù)

1）化合物1。白色固體，熔點（mp）為140～141 ℃。1HNMR（CDCL3，400 MHz）化學位移（δ）為7.52（2H， m），7.45（1H，d，J=15.9 Hz），7.36～7.31（3H，m），6.56（1H，d，J=16.0 Hz），5.95（1H，s），5.50（1H，d，J=1.5 Hz），3.83（3H，s）。13CNMR （CDCL3，100 MHz）δ為171.2（C），164.2（C），158.6（C），135.9（CH），135.4（C），129.6（CH），129.1（2CH），127.6（2CH），118.6（CH），101.6（CH），88.5（CH），55.9（CH3）。ESIMS（m/z）為479[2M+Na]+。

2）化合物2。淡黃色針狀結晶。1HNMR（CDCL3，

400 MHz）δ為7.58（2H，d，J=8.0 Hz），7.32（1H，d，J=16.0 Hz），6.95（2H，d，J=8.0 Hz），6.75（1H，d，J=16.0 Hz），6.08（1H，d，J=2.0 Hz），5.47（1H，d，J=2.0 Hz），3.86（3H，s），3.81（3H，s）。13CNMR（CDCL3，100 MHz）

δ為171.9（C），163.4（C），161.8（C），160.0（C），135.1（CH），129.9（2CH），129.1（C），118.0（CH），115.2（2CH），101.1（CH），88.9（CH），56.6（CH3），55.7（CH3）。ESIMS（m/z）為517[2M+1]+。

3）化合物3。白色針狀結晶。1HNMR（CDCL3， 400 MHz）δ為7.45（1H，d，J=16.0 Hz），7.08（1H，dd，J=2.0，8.0 Hz），7.03（1H，d，J=2.0 Hz），6.87（1H，d，J=8.0 Hz），6.45（1H，d，J=16.0Hz），5.91（1H，d，J=2.0 Hz），5.48（1H，d，J=2.0 Hz），3.93（3H，s），3.91（3H，s），3.83（3H，s）。13CNMR（CDCL3，100 MHz）δ為171.3（C），164.4（C），159.1（C），150.4（C），149.4（C），135.9（CH），128.4（C），121.4（CH），116.7（CH），111.1（CH），109.7（CH），100.7（CH），88.5（CH），56.1（CH3），56.0（CH3），56.0（CH3）。ESIMS（m/z）為577[2M+1]+。

4）化合物4。白色針狀結晶。1HNMR（CDCL3，

400 MHz）δ為7.22（1H，d，J=16.0 Hz），7.18（1H，dd，J=2.0，8.0 Hz），6.94（1H，d，J=8.0 Hz），6.65（1H，d，J=16.0 Hz），6.25（1H，dd，J=4.0，16.0 Hz），5.15（1H，d，J=2.0 Hz），5.00（1H，m），3.90（3H，s），3.89（3H，s），3.87（3H，s），2.67（1H，dd，J=12.0，16.0 Hz），2.55（1H，dd，J=4.0，16.0 Hz）。13CNMR（CDCL3，100 MHz）δ為172.8（C），167.2（C），149.5（C），149.8（C），133.4（CH），129.0（C），123.9（CH），120.5（CH），111.6（CH），109.5（CH），90.8（CH），76.4（CH），56.5（CH3），56.2（CH3），56.3（CH3），33.7（CH2）。ESIMS（m/z）為581[2M+1]+。

5）化合物5。白色針狀晶體。1HNMR（CDCL3，

400 MHz）δ為7.09（1H，d，J=1.6 Hz），6.95（1H，dd，J=1.6，8.0 Hz），6.83（1H，d，J=8.0 Hz），6.71（1H，d，J=16.0 Hz），6.28（1H，d，J=16.0 Hz），6.02（2H，s），5.17（1H，d，J=1.2 Hz），5.05（1H，m），3.82（3H，s），2.69（1H，ddd，J=1.2，12.0，16.0 Hz），2.59（1H，dd，J=4.8， 16.0 Hz）。13CNMR（CDCL3，100 MHz）δ為172.7（C），167.2（C），148.2（C），148.0（C），132.9（CH），129.9（C），123.7（CH），122.1（CH），108.5（CH），106.1（CH），101.5（CH2），90.8（CH），75.9（CH），55.9（CH3），33.8（CH2）。ESIMS（m/z）為549[2M+1]+。

6）化合物6。白色針狀晶體，mp為118～119 ℃。1HNMR （CDCL3，400 MHz）δ為6.79（1H，d，J=8.0 Hz），6.76（1H，d，J=1.2 Hz），6.72（1H，dd，J=1.2，8.0 Hz），5.95（2H，s），5.11（1H，d，J=1.2 Hz），4.34（1H，m），3.79（3H，s），2.77（1H，m），2.67（1H，m），2.40（1H，ddd，J=1.2，12.0，16.0 Hz），2.28（1H，dd，J=4.0，8.0 Hz），2.04（1H，m），1.85（1H，m）。13CNMR（CDCL3，100 MHz）δ為173.8（C），166.8（C），148.6（C），146.7（C），136.1（C），122.0（CH），109.6（CH），108.9（CH），101.7（CH2），90.7 （CH），75.5（CH），56.5（CH3），37.3（CH2），33.4（CH2），31.4（CH2）。ESIMS（m/z）為277[M+1]+。

2.2 各化合物結構解析

1）化合物1。白色晶體，由核磁數(shù)據(jù)以及ESIMS（m/z）為479[2M+Na]+確定化合物的分子質(zhì)量為228，分子式為C14H12O3，不飽和度為9。通過1HNMR譜結合13CNMR譜，化合物H的化學位移（δH）為7.52（2H，m）、7.36～7.31（3H，m），化合物C的化學位移（δC）為129.1（2CH）、127.6（2CH），說明化合物物中存在一個單取代的苯環(huán)；δH為7.45（1H，d，J=15.9 Hz）和6.56（1H，d，J=16.0 Hz），顯示該化合物中存在一對反式烯氫質(zhì)子；根據(jù)不飽和度以及δH為5.95（1H，s）、5.50（1H，d，J=1.5 Hz），δC為171.2（C），說明化合物中存在一個δ-lactone環(huán)；δH為3.83（3H，s）和δC為55.9（CH3）顯示存在一個氧甲基，因此該化合物是desmethoxyyangonin，其波譜數(shù)據(jù)與文獻[7]對照基本一致。

2）化合物2。淡黃色針狀結晶，ESIMS（m/z）為 517[2M+1]+，顯示出化合物的分子質(zhì)量為258，分子式為C15H14O4，不飽和度為9。1HNMR譜中，δH為7.58（2H，d，J=8.0 Hz）、6.95（2H，d，J=8.0 Hz），以及13CNMR譜顯示δC為129.9（2CH）、115.2（2CH），說明化合物中存在一個對位取代的苯環(huán)；δH為7.32（1H，d，J=16.0 Hz）、6.75（1H，d，J=16.0 Hz），顯示化合物中存在一對反式烯氫質(zhì)子；根據(jù)不飽和度和δH為6.08（1H，d，J=2.0 Hz）、5.47（1H，d，J=2.0 Hz），以及出現(xiàn)的羰基信號δC為163.4（C），可以推出化合物中存在一個δ-lactone環(huán)；另外根據(jù)δH為3.86（3H，s）、3.81（3H，s），以及δC為56.6（CH3）、55.7（CH3），說明存在兩個氧甲基，因此化合物的結構基本確定為yangonin，與文獻[8]對照基本一致。

3）化合物3。白色針狀結晶，ESIMS（m/z）為577[2M+1]+，顯示出化合物的分子質(zhì)量為288，結合NMR數(shù)據(jù)，推出分子式為C16H16O5，不飽和度為9。1HNMR中顯示δH為7.08（1H，dd，J=2.0，8.0 Hz）、7.03（1H，d，J=2.0 Hz）、6.87（1H，d，J=8.0 Hz），說明化合物中出現(xiàn)一個1，2，4-三取代的苯環(huán)；而δH為3.93（3H，s）、3.91（3H，s）、3.83（3H，s），結合13CNMR譜的δC為56.1（CH3）、56.0（CH3）、56.0（CH3），顯示化合物中存在3個氧甲基；通過與化合物11進行對比，發(fā)現(xiàn)化合物11和化合物12非常相似，惟一不同的是，化合物11苯環(huán)上的一個H被甲氧基所取代，因此化合物的結構被確定為11-methoxyyangonin，與文獻[9]對照基本一致。

4）化合物4。白色針狀結晶，ESIMS（m/z）為581[2M+1]+，顯示該化合物的分子質(zhì)量為290，分子式為C16H18O5， 不飽和度為8。通過與化合物3的分子式進行對比，發(fā)現(xiàn)化合物4比化合物3多了兩個H，在1HNMR中，δH為5.15（1H，d，J=2.0 Hz）、5.00（1H，m）、2.67（1H，dd，J=12.0，16.0 Hz）、2.55（1H，dd，J=4.0，

16.0 Hz），說明化合物3中的一個雙鍵發(fā)生了加氫反應，這樣也解釋了不飽和度少1的原因，因此化合物被確定為11-methoxy-5，6-dihydroyangonin，通過與文獻[10]對照，基本一致。

5）化合物5。白色針狀晶體，ESIMS（m/z）為549[2M+1]+，顯示化合物的分子質(zhì)量為274，結合NMR數(shù)據(jù)，推導出分子式為C15H14O5，不飽和度為9。δH為7.09（1H，d，J=1.6 Hz）、6.95（1H，dd，J=1.6，8.0 Hz）、6.83（1H，d，J=8.0 Hz），顯示該化合物中有一個1，2，4-三取代的苯環(huán)；δH為6.71（1H，d，J=16.0 Hz）、6.28（1H，d，J=16.0 Hz），顯示該化合物中存在一對反式烯氫質(zhì)子；δH為5.17（1H，d，J=1.2 Hz）、5.05（1H，m）、 2.69（1H，ddd，J=1.2，12.0，16.0 Hz）、2.59（1H，dd，J=4.8，16.0 Hz），以及13CNMR譜中出現(xiàn)的酯基信號δC為167.2（C），顯示化合物中存在一個δ-lactone環(huán)；根據(jù)不飽和度以及δH為6.02（2H，s），δC為148.2（C）、148.0（C）、101.5（CH2），說明化合物中存在一個包含兩個氧原子的五元環(huán)，因此化合物的結構被確定為methysticin，經(jīng)與文獻[8]對照，基本一致。

6）化合物6。白色針狀晶體，mp為118～119 ℃，ESIMS（m/z）為277[M+1]+，顯示化合物的分子質(zhì)量為276，結合NMR數(shù)據(jù)，推出化合物的分子式為C15H16O5，不飽和度為8。通過與化合物5比較，發(fā)現(xiàn)此化合物多了2個H，而通過核磁數(shù)據(jù)的比對，發(fā)現(xiàn)原來化合物4中的一個雙鍵發(fā)生加H反應，這個在1HNMR、13CNMR中得到體現(xiàn)，δH為2.77（1H，m）、2.67（1H，m）、2.04（1H，m）、1.85（1H，m），δC為37.3（CH2）、33.4（CH2），因此化合物被確定為dihydromethysticin，通過與文獻[11]對照，基本一致。

各化合物結構見圖1。

2.3 各化合物抗腫瘤活性測定結果

化合物1對細胞A549和細胞NCI-H460的半抑制濃度（IC50）分別為35.813 60和37.557 22 μg/mL，化合物2對細胞A549和細胞NCI-H460的IC50分別為13.566 71和13.685 84 μg/mL，化合物3對細胞A549和細胞NCI-H460的IC50分別為12.455 32和12.338 40 μg/mL，而化合物4、化合物5和化合物6對細胞A549和細胞NCI-H460的IC50均大于50 μg/mL。由此可知，化合物2和化合物3對人類癌細胞株[A549（非小細胞肺癌）、NCI-H460（人體肺癌細胞）]有很強的細胞毒活性，化合物1對這兩種細胞株有一定的細胞毒活性，而化合物4、化合物5和化合物6對這兩種細胞株沒有細胞毒活性。

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