花椒窄吉丁后腸、糞便揮發物的提取與鑒定

鞏雪芳 謝壽安 車顯榮

摘要：采用正己烷浸提法提取花椒窄吉丁（Agrilus zanthoxylumi）后腸、糞便揮發物，應用GC-MS技術分析其化學組分和相對含量。結果表明，花椒窄吉丁成蟲后腸揮發物種類和相對含量雌雄差異不大，主要為醛類和有機酸化合物，順-9-十六烯醛在雌雄蟲后腸揮發物中相對含量最高。雌蟲糞便揮發物以烴類和醇類化合物為主，分別以正四十烷（21.16%）和葉綠醇（8.53%）相對含量為最高；雄蟲以有機酸和烴類為主，分別以油酸（24.74%）和二十一烷（6.07%）相對含量為最高。雌、雄蟲糞便揮發物種類和相對含量差異很大。

關鍵詞：花椒窄吉丁（Agrilus zanthoxylumi）；正己烷；GC-MS；后腸；糞便

中圖分類號：S763.38 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）20-0079-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.20.017 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Studying the specific component composition and relative content of the volatile components in the hindgut and feces of Agrilus zanthoxylumi，the volatile components were extracted by n-hexane and which were analyzed by GC-MS. The results showed that the main components of the volatile substances in the hindgut of females and males were aldehydes and organic acids. The relative content of cis-9-hexadecenal in the hindgut volatiles from females and males was the highest. The differences in species and relative content of feces volatile from females and males were great，the main components of the femals feces volatile were hydrocarbons and alcohols，tetracontane（21.16%） and phytol（8.53%） were the highest，while hydrocarbons and organic acids were the main components in males，oleic acid（24.74%） and heneicosane（6.07%） were the highest. The species and relative contents of volatile matter in feces of female and male insects were very different.

Key words： Agrilus zanthoxylumi； n-hexane； GC-MS； hindgut； feces

花椒窄吉丁（Agrilus zanthoxylumi Hou）隸屬于鞘翅目（Coleoptera）吉丁蟲科（Bupresdae）窄吉丁屬（Agrilus），主要分布在中國北方花椒產區，如陜西、甘肅、山西、山東等省。在陜西省韓城、渭南、寶雞、洋縣、富平和甘肅省武都、天水、文縣的花椒園區發生較為嚴重[1]。幼蟲蛀食花椒樹皮，成蟲取食花椒葉片，造成缺刻、空洞[2]，在不同生育期，溫度和濕度主要影響其活動[3]。研究發現，花椒窄吉丁危害程度與椒園的地勢、地形和花椒品種無關[4]。目前對花椒窄吉丁的研究主要集中于化學防治和生物學特性方面[4-6]，利用天敵對其進行防控也有少量報道[7]，但關于信息素對花椒窄吉丁進行防治的研究尚未見報道[8]。

花椒窄吉丁在各地一年均發生一代，幼蟲在花椒樹皮坑道或木質部越冬，第二年2月至4月上旬開始活動，下旬開始化蛹，5月中下旬為化蛹盛期，蛹期大概28～43 d。6月中下旬為羽化盛期，7月中旬至8月初基本羽化完畢，成蟲期8～21 d。雌蟲產卵時沿著樹干或枝條慢慢爬行，遇樹皮縫隙、傷口及樹枝分叉處則產卵。卵一般散產，少數2～4粒聚成一堆。單雌平均產卵量為32粒，每產1粒卵需1 min左右[9]。7月上旬為產卵盛期，卵期9～15 d。6月底幼蟲開始孵化，7月中旬為孵化盛期。幼蟲危害可持續至11月下旬，然后陸續越冬，整個幼蟲期達240～280 d[3]。多年觀察發現，幼樹受害輕，老樹受害重；未掛果樹受害輕，掛果樹受害重；且掛果越多受害越重，凍害有利于蟲害的發生[10]。

利用昆蟲信息素防治害蟲是20世紀60年代以來發展起來的一種治蟲新技術，與化學防治手段相比，它具有靈敏度高、選擇性強、無毒、不污染環境、不殺傷天敵、不易產生抗藥性等優勢，已成為當今世界害蟲綜合管理的主要方向之一[11，12]；已經被廣泛應用于害蟲的測報和防治，特別是利用性信息素大量誘捕法和干擾交配法防治害蟲。成蟲糞便可能為昆蟲找尋異性提供信號[13]，目前已經從許多小蠹科昆蟲的后腸、糞便提取物中發現了具有生物活性的物質[10-12，14，15]。本研究主要通過對鞘翅目昆蟲花椒窄吉丁雌雄成蟲的后腸、糞便揮發性物質進行提取和鑒定，為花椒窄吉丁類信息素備選化合物的篩選及其寄主選擇機制研究和綠色防控技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲 花椒窄吉丁成蟲于2016年5-8月，采集于陜西省鳳縣白石鋪村山地的花椒園。借助捕蟲工具尋找在葉片、枝干上棲息的成蟲迅速將其捕捉，根據體型大小分別放入扎好透氣孔（4～10個）的4 mL或10 mL離心管中，每個離心管塞入一小片花椒葉片，雌雄蟲各自進行編號記錄后放入蟲籠。帶回實驗室置于25 ℃下飼養，定期進行死蟲清除和更換新花椒葉。

1.1.2 主要儀器 飼養瓶、解剖鏡、解剖刀、濾紙、冰箱、ISQ氣相色譜/質譜聯用儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、SPME手動進樣手柄（美國Supelco公司）、固相微萃取攪拌加熱平臺、DVB/CAR/PDMS萃取頭（纖維頭）（美國Supelco公司）、DB-5MS彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、樣品瓶、移液槍、組織研磨儀、分析天平、進樣瓶等。

1.2 揮發物的制備

1.2.1 后腸揮發物的提取 將花椒窄吉丁成蟲置于解剖鏡下雌雄分開后立即解剖，確定前腸、中腸和后腸的位置，切下各自后腸和相關組織（包括一部分中腸、馬氏管和脂肪體），立即放入裝有1.5 mL冷卻正己烷的棕色進樣瓶中，雌雄成蟲分別采集30根后腸，放入4 ℃冰箱靜置48 h后過濾，將濾液轉移至另一干凈的進樣瓶中，冷藏待用。

1.2.2 糞便揮發物的提取 將從野外采集到的花椒窄吉丁成蟲雌雄分開飼養，分別收集其糞便，用分析天平各稱取1 g，加入2 mL冷卻正己烷中，置于4 ℃冰箱中48 h后過濾，去除其中雜質，將上清液轉移至干凈的2 mL棕色進樣瓶中，冷藏待用。

1.3 揮發物的GC-MS分析與鑒定

采用直接進樣法，應用氣象色譜-質譜聯用儀GCMS-QP2010 Ultra（島津公司）對花椒窄吉丁雌性成蟲后腸、糞便揮發提取物進行GC-MS分析。GC條件：進樣口溫度250 ℃，rxi-5ms彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫60 ℃，保持2.5 min，以6 ℃/min升至210 ℃，然后以10 ℃/min升至230 ℃，保持15 min，載氣為高純He（99.999%），流速為1.0 mL/min；不分流進樣。MS條件：EI源，電離能為70 eV，離子源溫度230 ℃。質量掃描范圍為35～500 amu，質譜標準庫為NIST庫。

2 結果與分析

2.1 后腸揮發物GC-MS分析

2.1.1 花椒窄吉丁雌蟲后腸揮發物的GC-MS分析 通過GC-MS對花椒窄吉丁雌蟲后腸提取物定性定量分析。發現雌蟲后腸揮發物中共鑒定出31種物質，占峰面積的99.96%，總離子見圖1。其中，醛類化合物2種（總量42.37%），以順-9-十六烯醛的相對含量最多（40.51%）；有機酸化合物6種（總量22.84%），以棕櫚酸相對含量最多（13.90%）；酯類化合物3種（總量7.34%），以2-丙烯酸6-巰基酯含量最多（2.90%）；烴類化合物5種（總量5.42%），以正四十烷含量最多（3.51%）；醇類化合物3種（總量4.6%），此外，含少量的酮類、硅氧烷類化合物。

2.1.2 花椒窄吉丁雄蟲后腸揮發物的GC-MS分析 雄蟲后腸揮發物中鑒定共發現35種物質，占峰面積的100%，總離子見圖2。其中，醛類化合物1種（總量57.08%），為順-9-十六烯醛；有機酸化合物6種（總量20.45%），以棕櫚酸相對含量最多（12.58%）；酯類化合物2種（總量4.79%），以2-丙烯酸6-巰基酯含量最多（3.68%）；烴類化合物10種（總量5.42%），以正二十烷含量最多（1.50%）；醇類化合物2種（總量1.37%）；此外，含少量的酮類、硅氧烷類等化合物。

2.1.3 花椒窄吉丁雌、雄蟲后腸主要揮發物種類及相對含量的比較 通過花椒窄吉丁雌、雄蟲后腸揮發物的GC-MS總離子圖，采用峰面積歸一化法求出揮發性物質中各組分的相對含量，應用GC-MS和計算機聯機系統對各組分定性，并結合有關資料人工檢索確定其化學組成。

花椒窄吉丁雌雄蟲后腸主要揮發物（相對含量>0.5%）的比較見表1。研究發現，花椒窄吉丁雌、雄成蟲后腸揮發物中分別含有31種、35種化學成分，以醛類和有機酸類為主，比較花椒窄吉丁雌、雄蟲后腸主要的揮發性物質在化學組成及相對含量上的差異，雌、雄蟲后腸揮發物都是以順-9-十六烯醛含量最多，其次是棕櫚酸，認為是其后腸揮發物的主要成分，可見雌、雄蟲后腸主要揮發物在化學組成及相對含量上均無明顯差異。

2.2 糞便揮發性物質GC-MS分析

2.2.1 花椒窄吉丁雌蟲糞便揮發物的GC-MS分析 根據花椒窄吉丁雌蟲糞便總離子流氣相色譜圖檢測出共83種物質，占峰面積的99.34%，總離子見圖3。其中，烴類化合物12種（總量52.11%），相對含量最多為正四十烷（21.16%）；醇類化合物18種（總量16.65%），相對含量最多為葉綠醇（8.53%）；酯類化合物16種（總量9.54%），含量最多的為丁基十七烷亞硫酸酯（3.24%）；酮類化合物12種（總量6.23%），含量最多的為膽甾-3，5-二烯-7-酮（2.88%）；有機酸化合物7種（總量3.71%）；此外，含少量的萜烯類、苯酚等化合物。

2.2.2 花椒窄吉丁雄蟲糞便揮發物的GC-MS分析 由花椒窄吉丁雄蟲糞便總離子氣相色譜圖檢測出共85種物質，占峰面積的99.99%，總離子見圖4。其中，有機酸化合物10種（總量59.80%），相對含量最多為油酸（24.74%）；烴類化合物12種（總量14.82%），相對含量最多為二十一烷（6.07%）；酯類化合物20種（總量10.03%），含量最多為L-抗壞血酸棕櫚酸酯（5.22%）；酮類化合物12種（總量6.23%），相對含量最多為葉綠醇（5.41%）；此外，含有少量的萜烯類、酮類、醛類等化合物。

2.2.3 花椒窄吉丁雌、雄蟲糞便主要揮發物種類及相對含量的比較 花椒窄吉丁雌、雄蟲糞便主要揮發物（相對含量>0.5%）的比較結果（表2）表明，雌、雄成蟲糞便揮發物中分別含有83種、85種化學成分，雌蟲主要為烴類和醇類（占68.76%），雄蟲主要為有機酸和烴類（占74.62%），可知糞便揮發物組成在性別上差異明顯。花椒窄吉丁雌、雄成蟲糞便揮發物在化學組成及相對含量上除2-羥基桉葉素和二十一烷外差異顯著，雌蟲糞便揮發物的主要成分是烷烴（三十六烷和四十烷），而雄蟲糞便揮發物的主要成分是有機酸（棕櫚酸和油酸）。

3 小結與討論

昆蟲糞便在寄生性和捕食性天敵的生態關系中扮演重要角色[16，17]，也是寄主的選擇和定位行為的信息素來源[18]，糞便的化學信號與幼蟲緊密相關，這樣能對幼蟲找尋寄主提供更有效的信息[19，20]。對沙漠蝗的聚集行為研究后認為卵囊、糞便、蟲體都產生不同的信息素[21]，故分析引起花椒窄吉丁雌、雄蟲糞便揮發物組分在性別上的差異可能的原因是雌、雄蟲性信息素的形成需特異性選擇消化吸收，從直腸排出的物質也有不同，而起初進食都是相同的，也能解釋后腸揮發物差異不大，這又進一步說明性誘劑的研發更需要參照糞便排泄物。

本研究在花椒窄吉丁后腸揮發物中大量發現的順-9-十六烯醛已被證明是多種昆蟲[22-25]的信息素成分，并已被研發成性誘劑，關于順-9-十六烯醛是否是花椒窄吉丁的性信息素成分還有待通過生物學等活性測定方法繼續深入探討。

正己烷浸提法是常用的提取昆蟲后腸和糞便揮發物的方法，前人已有很多研究[26-28]，但是不能夠完全有效地提取昆蟲后腸和糞便的揮發物成分，會帶來雜質，存在損失。吳丹等[29]在2017年研究了一種快速分析人和大鼠糞便中堿性和中性揮發性代謝產物的氣相色譜-質譜聯用法，簡單、靈敏，可用于糞便樣品中堿性和中性揮發性代謝產物的分析。但是想要得到昆蟲后腸和糞便揮發物成分的準確分析，建議今后選擇損失更小的揮發物提取方法。如固相微萃取技術，一種無需溶劑的揮發物質快速提取法，準確性高，重現性好，能夠更加真實地反映所萃取樣品中揮發性物質的真實成分和各成分比例，成為近年來揮發性物質研究的主要手段。

植食性昆蟲表皮分泌的化學信息物質對其行為也有很重要的作用[30]，此外蝗蟲表皮抽提物中也有聚集信息素的存在[31]。Peterson等[32]提取了表皮碳氫化合物并分析其在雄性交配選擇和生殖隔離的作用。表明今后對于花椒窄吉丁昆蟲信息素還有很廣泛的領域有待深入探究，要想實現對其進行綜合防控，更需探究其表皮分泌的化學信息物質。幼蟲糞便也能夠驅避雌性成蟲產卵在其附近，以減少后代的競爭。鞘翅目松墨天牛幼蟲的糞便就有這種產卵忌避作用[33]。所以期望在今后對花椒窄吉丁研究中也能夠實現對其幼蟲糞便成分及其相對含量分析，以期豐富花椒窄吉丁的昆蟲信息素物質種類；為進一步揭示花椒窄吉丁寄主侵害機理提供理論依據，為今后可持續治理農林業害蟲提供技術支撐。

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