菌草種質(zhì)資源AFLP多樣性分析

梅嘉洺++葛紅柳++劉翠翠+朱專為++ALAM+Intikhab++陽宴清++盧運海

摘 要 利用AFLP技術(shù)對48份菌草種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析。首先，在海南象草等4份菌草材料上檢測了20個AFLP引物組合的擴增情況。然后，從中篩選出6個擴增效果較好的組合用來進一步分析48份菌草種質(zhì)材料的DNA，共產(chǎn)生了208個多態(tài)性條帶。用NTSYS-pc 2.1軟件結(jié)合UPGMA聚類分析方法對數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果顯示，48份種質(zhì)材料間遺傳相似系數(shù)（SM）在0.48～0.98，在遺傳相似系數(shù)為0.57時可將48份材料分成4個類群。以上研究結(jié)果表明，AFLP分子標(biāo)記技術(shù)的分析結(jié)果能直觀地表現(xiàn)菌草種質(zhì)材料之間的親緣關(guān)系，為菌草種質(zhì)資源的收集和評價提供了一項新的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞 菌草 ；AFLP ；分子標(biāo)記 ；種質(zhì)資源 ；遺傳多樣性

中圖分類號 S326 文獻標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.11.007

Diversity Analysis of JUNCAO Germplasms by AFLP Markers

MEI Jiaming1，2） GE Hongliu1） LIU Cuicui1）

ZHU Zhuanwei1） ALAM Intikhab1） YANG Yanqing1） LU Yunhai1）

（1 Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics， Breeding and Multiple Utilization of Crops，

College of Crop Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Jinshan， Fuzhou 350002；

2 China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology， Fuzhou 350002， China）

Abstract In this study， AFLP technique was used to study the genetic diversity of 48 JUCAO germplasms. A total of 20 combinations of AFLP primer pairs were firstly tested on a subset of four samples. Then six combinations of AFLP primer pairs were selected and analyzed the DNA of 48 JUNCAO germplasms and a total of 208 polymorphic DNA fragments were obtained. The genetic similarity coefficient （SM） was estimated among all accessions by NTSYS-pc 2.1 software and ranged from 0.48 to 0.98. The 48 JUNCAO materials were separated into four clusters when the SM was 0.57. The results showed that the AFLP technique could more directly reveal the genetic difference among different accessions， and be served as a new technique for the collection and evaluation of JUNCAO germplasms.

Keywords JUNCAO ； AFLP ； molecular marker ； germplasm ； genetic diversity

菌草（JUNCAO）的概念最早是由福建農(nóng)林大學(xué)林占熺研究員[1]于1986年提出，是指可用來做食用菌、藥用菌培養(yǎng)基的草本植物。菌草技術(shù)（JUNCAO Technology）是指“以草代木”用菌草栽培食（藥）用菌以及菌料加工等綜合性新技術(shù)[1-2]。利用菌草技術(shù)及相關(guān)技術(shù)形成的產(chǎn)業(yè)被稱作菌草產(chǎn)業(yè)（JUNCAO Industry）[1-2]。可以用作菌草的植物種類很多，既包括芒萁、五節(jié)芒、類蘆、蘆竹、蘆葦?shù)纫吧牟荼局参铮舶ň蘧荨⑾蟛荨⒆舷蟛荨⑾愀荨⒆匣ㄜ俎！⒋~草、綠洲系列蘆竹等人工栽培的草本植物，廣義的菌草還包括玉米、高粱、甘蔗等作物[1]。某些菌草品種還可用于生產(chǎn)生物燃料、造紙、生態(tài)治理等[3-5]。目前菌草技術(shù)已在我國多個省份得到推廣，并被傳播到世界上100多個國家[5]。隨著菌草技術(shù)的不斷改進和菌草產(chǎn)業(yè)的不斷壯大，有關(guān)菌草種質(zhì)資源的收集、保存、鑒別和利用等工作變得越來越迫切和重要。然而由于菌草的種類繁多、來源廣泛，所以使得菌草在種質(zhì)資源的收集、保存和評價等方面有一定的盲目性。因此，運用分子標(biāo)記技術(shù)來研究菌草種質(zhì)資源的遺傳多樣性顯得尤為重要。

目前有關(guān)菌草種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究報道很少。梅嘉洺等[6]首次在菌草上利用PCR-RFLP技術(shù)對46份種質(zhì)資源的PEPC基因進行了多樣性分析，之后有李嬋等[7]、趙永紅等[8]和黃曉霞等[9]分別在菌草上用iPBS、SCoT和SRAP標(biāo)記技術(shù)做了遺傳多樣性分析。研究結(jié)果表明，4種技術(shù)雖然操作簡單，并且都能將所分析的菌草種質(zhì)材料區(qū)別開，但每個單個反應(yīng)所產(chǎn)生的分子標(biāo)記數(shù)量較少，并且iPBS、SCoT和SRAP技術(shù)所用的引物特異性差，因而會降低其結(jié)果的可重復(fù)性。AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性）是由荷蘭科學(xué)家Vos等在1995年發(fā)明的分子標(biāo)記技術(shù)[10]，它是基于PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）的一種選擇性擴增限制性DNA片段的方法，可在一次單個反應(yīng)中檢測到大量的片段，是一種高效能的DNA指紋技術(shù)，它同時具有RFLP技術(shù)的高重復(fù)性和PCR技術(shù)的簡便快捷等優(yōu)點，因而被廣泛應(yīng)用于多種植物的親緣關(guān)系鑒定、遺傳資源多樣性分析以及遺傳圖譜構(gòu)建等方面的研究[10-31]。本研究利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對48份菌草種質(zhì)資源遺傳多樣性進行了分析，為菌草的種質(zhì)資源研究提供了一種新的技術(shù)手段，獲得的結(jié)果可為菌草種質(zhì)資源的收集、評價和利用提供科學(xué)的理論指導(dǎo)和依據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的菌草材料（表1）主要來自于福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心的種質(zhì)資源圃，其中的西充1號蘆竹采集于四川西充。取樣時，采集各品種幼嫩葉片約5 g，裝入編號的塑料袋中，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩１狙芯克玫降囊铮ū?）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和檢測

基因組DNA的提取采用了改良后的CTAB法[33]。首先將提取到的每個材料的總DNA在1.2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測其長度及質(zhì)量，然后在Nanodrop 2000（Thermo Fisher）分光光度計上測定所提取DNA樣品的濃度，最后根據(jù)測定濃度將每個樣本的DNA濃度稀釋至200 ng/μL作為備用母液，所有材料的DNA樣本均保存于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 AFLP分析

（1）限制性酶切與鏈接 基因組DNA采用Eco RI 和Mse I酶切，酶切體系總體積為20 μL，其中包括模板DNA 6 μL、10×Buffer 2 μL、Eco RI 和Mse I 各2 μL、ddH2O 8 μL，混勻后37℃水浴3 h。再加入Eco RI 接頭（AdaptEco，5 μM）1 μL、Mse I接頭（AdaptMse，45 μM）1 μL、10×T4 DNA ligase Buffer 3 μL、T4 DNA ligase（TakaRa，350 U/μL）1 μL、ddH2O 4 μL，混勻后放置在PCR反應(yīng)儀上16℃連接過夜。

（2）預(yù)擴增 反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中包括模板DNA（上述鏈接產(chǎn)物）2 μL、2×Taq PCR Startmix（Genstar）10 μL、預(yù)擴增F引物（PreampEc_F，10 μM）1 μL、預(yù)擴增R引物（PreampMs_R，10 μM）1 μL、ddH2O 6 μL，混勻后放置在PCR反應(yīng)儀上進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為94℃ 4 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保存。

（3）選擇性擴增 PCR反應(yīng)的總體積為20 μL。其中包含了DNA模板（上述預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋液）5 μL、AFLP選擇性引物E（10 μM）1 μL、AFLP選擇性引物M（10 μM）1 μL、2×Taq PCR Startmix（Genstar）10 μL，ddH2O 3 μL。混勻后放置在PCR反應(yīng)儀上進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件為94℃ 3 min；94℃ 30 s，65℃（每輪循環(huán)遞減0.7℃）30 s，72℃ 1 min，12個循環(huán)；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，25個循環(huán)；72℃ 10 min； 4℃保存。

（4）聚丙烯酰胺凝膠電泳和成像分析 將選擇性擴增產(chǎn)物與等體積的變性劑loading buffer混和，在PCR反應(yīng)儀上94℃變性5 min后立即放入冰浴中冷卻至加樣電泳。取4 μL加樣于已經(jīng)預(yù)電泳15 min的6%的變性聚丙烯酰胺膠，在1 500 V的電壓下垂直電泳90 min，然后用快速銀染法檢測選擇性擴增產(chǎn)物[34]，對染色結(jié)果進行拍照、分析和保存。

1.3 統(tǒng)計分析

在電泳圖譜上選擇清晰、穩(wěn)定、多態(tài)的擴增條帶，根據(jù)其在不同樣本上分離情況進行統(tǒng)計：有條帶的記為1，無條帶的記為0，構(gòu)建（0，1）矩陣。然后利用NTSYS-pc 2.1軟件中的子程序SIMQUAL對矩陣進行樣本間的相似性系數(shù)（SM）計算，再用子程序SAHN中的非加權(quán)類平均法（UPGMA）進行聚類分析，最后用Tree plot繪制出樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP反應(yīng)過程的檢測

為確保AFLP反應(yīng)獲得可靠的結(jié)果，對48份菌草種質(zhì)材料DNA的預(yù)擴增產(chǎn)物進行了1.2%瓊脂糖電泳檢測（圖1）。結(jié)果顯示，每個樣本DNA的預(yù)擴增產(chǎn)物都給出了所期望的拖帶；除了1號樣本外，其余47份材料DNA的預(yù)擴增產(chǎn)物在電泳圖上顯示相對均勻。據(jù)此，將1號樣本DNA的預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋50倍，而其余47份樣本DNA的預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋100倍，作為DNA模板用于下一步的選擇性擴增反應(yīng)。

2.2 遺傳多樣性分析

首先在4個代表性菌草種質(zhì)材料（海南象草，綠洲2號，甘蔗MOL-6081，聚穗高粱）上試用了20對引物組合，結(jié)果表明，所試用每個引物組合都能在4個菌草材料上擴增出50～100條強度不同、清晰、相對均勻、多態(tài)的DNA片段來，引物組合之間沒有觀察到明顯的區(qū)別，因此無需進行引物組合篩選。然后，隨機選用了6對引物組合對表1中的48份菌草種質(zhì)材料進行了AFLP分析，圖2顯示引物組合E-AC/M-CA在48份菌草種質(zhì)材料上的PCR選擇性擴增結(jié)果圖。在48個樣本上，分析單個AFLP引物組合擴增結(jié)果可以獲得20～62個多態(tài)性DNA片段（表3），分析6個AFLP引物組合共獲得了208個多態(tài)性片段，平均每個引物組合獲得34.7個多態(tài)性片段。聚丙烯酰胺膠電泳膠的染色質(zhì)量的好壞直接影響到可讀多態(tài)性DNA片段的數(shù)目。

2.3 菌草種質(zhì)的聚類分析

對48份菌草種質(zhì)資源上獲得的208條AFLP多態(tài)片段進行UPGMA聚類分析，所得到的結(jié)果如圖4所示。聚類結(jié)果表明，所研究的48份材料之間的遺傳相似性系數(shù)（SM）分布在0.48～0.98，在遺傳相似性系數(shù)為0.57時可將48份菌草種質(zhì)材料分成1、2、3、4四大類群（圖3）。

第1大類群中包括了25份種質(zhì)材料，是最大的一個類群，該類群的所有成員都屬于狼尾草屬（Pennisetum），又可分為兩個亞類群：第一個亞類包括巨菌草1號、巨菌草、王草、雜交象草、海南象草、象草N85、象草、桂牧1號、細莖象草、漳州象草、熱研4號粗莖象草、桂閔引象草、南牧2號、萊牧1號、桂草1號、矮象草、紅象草、萊牧、雜交狼尾草、巴西蔗、象草N51、臺灣甜草、高丹草變種等23份材料，它們之間的相似系數(shù)都在0.95以上；第二亞類僅包括狼尾草和美洲狼尾草兩份材料，二者之間的相似系數(shù)為0.965。而兩個亞組之間的相似系數(shù)僅為0.58，表明狼尾草和美洲狼尾草兩個材料和類群內(nèi)的其它23份材料之間的親緣關(guān)系較遠。endprint

第2大類群中包括了11份種質(zhì)，其中彼特草、閔牧42、甘蔗MOL-6081和甘蔗LA-Purple等4個甘蔗屬（Saccharum）材料形成一個小組，它們之間的相似系數(shù)在0.772～0.946；兩個高粱屬（Sorghum）材料（聚穗高粱和散穗高粱）形成一個小組，兩者之間的相似系數(shù)為0.958；類群內(nèi)的其余5份材料，如81.95象草（Pennisetum）、五節(jié)芒（Miscanthus）、莆田蘆葦（Phragmitas）、薏苡（Coix）、斑毛（Saccharum）等，相互之間親緣關(guān)系相距則較遠，相似系數(shù)在0.571～0.639。

第3大類群僅包括了類蘆（Neyraudia）和海南水竹（Phyllostachys）2份種質(zhì)材料，兩份材料之間的親緣關(guān)系較遠，相似系數(shù)僅為0.61。

第4大類群中包括了蘆竹屬（Arundo）的10份種質(zhì)材料，其中綠洲7號和其余材料的遺傳距離最遠（SM= 0.792）。綠洲1、2、4、5、7、8號及花葉蘆竹聚合成1個亞組，而綠洲3號、4號和西充1號蘆竹聚合成另一個亞組，兩個亞組之間的相似系數(shù)為0.888.

3 討論與結(jié)論

AFLP分子標(biāo)記同時匯集了RFLP和PCR技術(shù)的優(yōu)點，只需要少量的起始DNA樣本（100～200 ng）就可以產(chǎn)生大量的分子標(biāo)記信息，而且引物設(shè)計不需要事先知道基因組的DNA序列，產(chǎn)生的結(jié)果重復(fù)性好、靈敏度高，不需要特別昂貴的儀器和耗材，操作步驟也相對簡單，因而很適合在那些基因組研究進展比較滯后的植物上使用[10-32]。菌草的種類多、來源廣，其中的狼尾草屬和蘆竹屬植物，雖然有許多被開發(fā)利用的潛力[1-5]，但目前還很少有人去系統(tǒng)的研究它們。本研究利用6對AFLP引物組合分析了48份菌草種質(zhì)材料，共獲得了208個多態(tài)片段，將48份材料全部區(qū)別開來，展示了AFLP技術(shù)在這些植物上的應(yīng)用潛力。本研究的聚類分析結(jié)果驗證了先前利用PCR-RFLP[6]、iPBS[7]、SCoT[8]和SRAP[9]技術(shù)所獲得的遺傳多樣性分析結(jié)果；同時，與先前的研究結(jié)果[6-9]相比較，本研究使用的AFLP技術(shù)更能揭示屬間的遺傳變異（圖3）；但是，狼尾草屬（Pennisetum）內(nèi)，狼尾草和美洲狼尾草兩份材料和屬內(nèi)的其它材料之間的差異較先前的結(jié)果[6-9]更加明顯。此外，本研究較先前的研究增加了1份新的材料（西充1號蘆竹），采集于四川西充市郊，聚類分析顯示它和綠洲3號、6號聚合在同一個亞組，但它們間的相似系數(shù)僅為0.93，證明目前收集到的蘆竹屬材料還不能全面的代表我國蘆竹的遺傳資源，因此，蘆竹的資源收集工作還具有很大潛力。

相比傳統(tǒng)的利用含有3個特異堿基的選擇性引物進行選擇性擴增的AFLP技術(shù)[10-32]，本研究選用了只含有2個特異堿基的選擇性引物進行選擇性擴增（表2），這樣可以增加擴增出的AFLP片段數(shù)目，在品種檢測或區(qū)分時更具有指紋效應(yīng)，因而效率更高。但是，由此所產(chǎn)生的大量的DNA擴增片段需要和具有更高分辨率的電泳技術(shù)及更靈敏的染色技術(shù)相配合。未來可以將該技術(shù)結(jié)合熒光染色技術(shù)及自動或半自動DNA分析儀（如雙色紅外熒光檢測設(shè)備LiCOR 4300），從而彌補傳統(tǒng)銀染技術(shù)的結(jié)果不穩(wěn)定、分辨率不高、使用有毒試劑等缺點，獲得更加高效、可靠和穩(wěn)定的結(jié)果。

總之，本研究利用6對AFLP引物組合分析了48份菌草種質(zhì)材料，展示了AFLP標(biāo)記技術(shù)在菌草種質(zhì)材料的區(qū)分和鑒定方面的應(yīng)用潛力，為菌草種質(zhì)資源的管理和評價提供了一個新的技術(shù)選項。

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